超高效合相色譜法對6種三唑類農(nóng)藥對映體的拆分及其在黃瓜中的殘留分析

張文華, 謝 文*, 侯建波, 陳欽可, 李淑敏, 祝澤龍, 鄒學權, 徐敦明

(1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院, 浙江 杭州 310016; 2.浙江立德產(chǎn)品技術有限公司, 浙江 杭州 310016; 3.廈門海關技術中心, 福建 廈門 361026)

手性是自然界普遍存在的現(xiàn)象,隨著科學的發(fā)展,對光學純物質的需求量越來越大,手性對映體分離日益引起人們的關注。傳統(tǒng)的手性農(nóng)藥研究,不區(qū)分對映體,將所有對映體視為同一物質來對待,GB 2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中只是規(guī)范了農(nóng)藥的外消旋體使用安全標準,并未精確規(guī)定每種農(nóng)藥的有功效且低毒性的對映體和無功效且高毒性的對映體殘留限量。然而,手性農(nóng)藥的不同對映體在生物過程及環(huán)境介質中,往往存在著立體選擇性行為。如三唑醇有2個手性中心,因此有4個對映異構體,這4個光學異構體殺菌能力完全不同,左旋體的藥效高于右旋體,毒性還比右旋體低[1]。而GB 2763-2016規(guī)定茄果類蔬菜中三唑醇的最高殘留限量≤1.0 mg/kg,如果能進一步研究三唑醇的4種對映體在蔬菜水果中的殘留量,那將能為三唑醇對映體殘留分析提供精確的判定。

三唑類農(nóng)藥作為一類高效殺菌劑,能有效保護水果、大豆、谷物等農(nóng)作物免受細菌侵害,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用非常廣泛[2]。該類化合物分子中均含有1個或2個手性中心,即存在2個或4個對映體結構。目前三唑類農(nóng)藥手性分離主要是通過色譜方法實現(xiàn)的,如電泳(CE)[3-7]、氣相色譜法(GC)[8,9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-12]和超臨界流體色譜法(SFC)[1,13]等均有成功拆分的研究報道。對映體的物理化學性質相似,傳統(tǒng)手段拆分較為困難。所需拆分時間通常在30 min以上,可能需要幾根手性柱配合使用,有些對映體拆分效果不理想。近年來新推出的超高效合相色譜(UPC2)的流動相為壓縮二氧化碳,是一種介于氣體和液體之間的超臨界流體,流體黏度小,比HPLC中所使用的液體流動相擴散率更高、更有利于傳質。同時,所使用的手性色譜柱是基于亞2 μm粒徑填料的色譜柱,粒徑小,理論塔板數(shù)高,分離效率高。溫度和壓力的微小變化能引起UPC2流動相的密度和溶解能力的較大差異,通過精確地調(diào)節(jié)流動相強度、壓力和溫度獲得所需要的系統(tǒng)分辨率和選擇性,從而對待測物的保留和分離進行有效調(diào)控。這非常適合結構類似物、異構體以及對映體和非對映體的分離、檢測和定量[14-16]。目前,UPC2技術應用于三唑類農(nóng)藥對映體的分離和相應對映體的殘留測定鮮有報道。

為了解決上述對映體拆分測定的難題,本文建立了一種超高效合相色譜法拆分三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑6種三唑類農(nóng)藥對映體及測定其對映體在黃瓜基質中殘留量的方法。方法的回收率和精密度均符合殘留檢測的要求。對藥物的使用效果、殘留量判定和新藥開發(fā)有重要的指導意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效合相色譜儀(美國沃特世公司);臺式離心機(美國Thermo公司); R215旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); AE260電子天平(瑞士Mettler公司); MS2渦旋混勻器(上海醫(yī)大儀器廠);超純水凈化系統(tǒng)(英國Elga公司);微孔過濾膜(0.22 μm,有機相);氮吹儀(日本東京理化公司)。

正己烷、丙酮、乙腈(色譜純,西班牙Scharlau公司);無水硫酸鈉(分析純,450 ℃灼燒,上海試四赫維化工有限公司);弗羅里硅土(Florisil)吸附劑(優(yōu)級純,100～200目,國藥集團化學試劑有限公司,650 ℃灼燒24 h, 使用2%超純水滅活后備用);石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)和C18(優(yōu)級純,上海安譜科學儀器有限公司);無水硫酸鎂(分析純,西隴科學股份有限公司); QuEChERS試劑(含有PSA 50 mg、C18 50 mg、GCB 7.5 mg、無水硫酸鎂150 mg);水為超純水;其他實驗所用試劑除特殊說明外均為分析純。

6種外消旋體:三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑(純度≥99%,德國Dr Ehrenstorfer 公司)。

16種對映體:(+)-S-三唑酮、(-)-R-三唑酮、(-)-(S,R)-三唑醇、(+)-(R,S)-三唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇、(+)-(R,R)-三唑醇、(+)-己唑醇、(-)-己唑醇、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-聯(lián)苯三唑醇-A、(+)-聯(lián)苯三唑醇-A、(-)-聯(lián)苯三唑醇-B、(+)-聯(lián)苯三唑醇-B、(+)-腈菌唑、(-)-腈菌唑(純度均大于95.0%,上海勤路生物技術有限公司)。

1.2 標準溶液及試劑配制

1.2.1外消旋體標準溶液

6種三唑類農(nóng)藥儲備液(1.0 g/L):分別稱取0.01 g(精確至0.1 mg)上述三唑類農(nóng)藥外消旋體標準品,用正庚烷分別溶解定容至10 mL, 4 ℃避光保存。

標準中間溶液:分別準確量取適量的三唑酮、三唑醇、己唑醇、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑外消旋體標準儲備液,依次用正庚烷稀釋配制成6組20.0 mg/L的外消旋體標準溶液(用于后續(xù)外消旋體的拆分), 4 ℃避光保存。

1.2.2對映體標準溶液

16種三唑類農(nóng)藥對映體儲備液(1.0 g/L):分別稱取0.01 g(精確至0.1 mg)上述三唑類農(nóng)藥對映體標準品,用正庚烷分別溶解定容至10 mL, 4 ℃避光保存。

分別準確量取適量的對映體儲備液,依次用正庚烷稀釋配制成16種20.0 mg/L的對映體標準溶液(用于確定16種對映體的保留時間), 4 ℃避光保存。

標準中間溶液:分別準確量取幾種適量的對映體儲備液,混合,用正庚烷稀釋配制成100.0 mg/L的標準中間溶液,于4 ℃避光保存。標準中間溶液共4組,如下:A組包括(+)-S-三唑酮、(-)-R-三唑酮、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-聯(lián)苯三唑醇-A、(+)-聯(lián)苯三唑醇-A、(-)-聯(lián)苯三唑醇-B和(+)-聯(lián)苯三唑醇-B共8種對映體;B組包括(-)-(S,R)-三唑醇、(+)-(R,S)-三唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇、(+)-(R,R)-三唑醇共4種對映體;C組包括(+)-己唑醇和(-)-己唑醇2種對映體;D組包括(+)-腈菌唑和(-)-腈菌唑2種對映體。

標準工作溶液(用于黃瓜樣品殘留實驗分析):準確吸取一定量的標準中間溶液A、B、C、D,用乙腈分別稀釋至0、1.0、2.0、4.0、10 mg/L的標準工作溶液A、B、C、D, 4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

稱取試樣10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,均質提取,再加入3.0 g氯化鈉,渦旋混勻,4 000 r/min離心5 min后,移取上清液至盛有0.5 g石墨化炭黑的50 mL離心管中,渦旋1 min后,以8 500 r/min離心5 min,轉移上清液至濃縮瓶中,向剩余殘渣中再加入20 mL乙腈重復上述提取步驟,合并兩次提取液,用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至近干,用50 mL丙酮-正己烷(1∶1, v/v)溶液復溶。

1.3.2凈化

將復溶液轉移至裝有10 g脫活弗羅里硅土玻璃管中(使用前已做過淋洗曲線),上樣后用濃縮瓶直接接收凈化液,用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至近干,用1 mL乙腈定容,定容液用QuEChERS試劑凈化,15 000 r/min離心5 min后,經(jīng)0.22 μm混合型濾膜過濾作為測定液。

1.4 色譜條件

色譜柱:Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料為改良的多糖型手性固定相,美國Waters公司);助溶劑:甲醇(三唑酮、三唑醇、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇),異丙醇-無水乙醇(1∶1, v/v)溶液(己唑醇、腈菌唑);動態(tài)備壓(ABPR): 17.2 MPa;流速:2.5 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:40 ℃;檢測波長:250 nm(聯(lián)苯三唑醇), 220 nm(其他5個化合物)。

1.2.2節(jié)中的4組對映體標準工作溶液A、B、C、D按照各自優(yōu)化的色譜條件和未知樣品的定容液一起進樣測定。

2 結果與討論

除三唑醇和聯(lián)苯三唑醇有兩個手性中心、4個對映體外,其他4種農(nóng)藥都只有1個手性中心、2個對映異構體?？紤]到6種農(nóng)藥結構上具有一定的相似性,本實驗嘗試用一根手性柱(Acquity Trefoil AMY1)在UPC2上拆分這6種農(nóng)藥。

2.1 穩(wěn)定性和定容液試劑的考察

將三唑類農(nóng)藥溶解于正庚烷中,配成1.0 g/L標準品溶液,于-18 ℃下保存放置。考察剛配制時所測得的農(nóng)藥含量和分別儲存1、3、5、7、14、30、60天后的農(nóng)藥含量。結果顯示,6種三唑類農(nóng)藥外消旋體于-18 ℃下放置14天時含量變化均小于10%,放置30天時含量降低了13%～42%,放置60天時含量降低了20%～67%,說明6種三唑類農(nóng)藥的外消旋體在14天內(nèi)比較穩(wěn)定(見圖1)。6種三唑類農(nóng)藥對映體含量都是呈逐漸降低趨勢,其中三唑醇的一個對映體(-)-(S,S)-三唑醇和戊唑醇的一個對映體(-)-R-戊唑醇于-18 ℃下放置14天時含量降低了10%以上,而放置7天時含量變化小于10%,其他對映體于-18 ℃下放置14天時含量變化均小于10%,說明6種三唑類農(nóng)藥的對映體在7天內(nèi)比較穩(wěn)定。

圖1 6種三唑類農(nóng)藥外消旋體儲備液在正庚烷中60天內(nèi)的穩(wěn)定性考察

實驗前處理過程中樣品濃縮10倍,雜質含量很高,對凈化條件要求很高,因此實驗中除了經(jīng)過自制弗羅里硅土柱凈化之外,定容液還要加QuEChERS試劑進行凈化。標準工作溶液和定容液采用正庚烷試劑溶解,實驗結果表明,定容液加QuEChERS試劑凈化后,三唑醇對映體幾乎被全部吸附,三唑酮的兩個對映體分別被吸附了74%和79%,戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和己唑醇的對映體分別被吸附了11%～36%,而采用乙腈試劑定容溶解,定容液加QuEChERS試劑凈化后,這6種三唑類對映體被吸附量均小于5%,說明目標化合物在乙腈環(huán)境下幾乎不會被吸附。雖然在正庚烷試劑中6種三唑類農(nóng)藥的對映體峰形更好,但是為了避免目標化合物被QuEChERS試劑吸附,故最終標準工作溶液和定容液均采用乙腈試劑。同時,本實驗按照上述方法考察了6種三唑類農(nóng)藥外消旋體和對映體的工作溶液在乙腈中的穩(wěn)定性,結果表明,標準工作溶液在乙腈中可以保存7天。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

UPC2所采用的流動相是以二氧化碳超臨界流體為主體,配比不同有機溶劑作為助溶劑來調(diào)節(jié)流動相的極性和溶解性,有效改變目標物的峰形和保留時間,以獲得最佳的分離效果,常用的助溶劑通常為甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇等。在其他色譜條件不變的情況下,考察流動相分別選擇甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇為有機改性劑時對6種三唑類農(nóng)藥手性分離的影響。結果顯示,以甲醇作為有機改性劑時,三唑酮、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和三唑醇對映體均達到良好拆分,己唑醇和腈菌唑的對映體無法達到良好的分離。而以異丙醇-乙醇為有機改性劑時,己唑醇和腈菌唑對映體均達到良好拆分。因此,針對該6種三唑類農(nóng)藥對映體的手性拆分,本實驗采用了兩種助溶劑,三唑酮、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇和三唑醇采用甲醇作為助溶劑,己唑醇和腈菌唑采用異丙醇-乙醇作為助溶劑。

超高效合相色譜中,動態(tài)背壓也是影響分離過程的重要因素之一,其主要作用是控制CO2在整個操作過程中處于超臨界流體狀態(tài)。在不同的動態(tài)背壓下,CO2超臨界流體對樣品有著不同的溶解能力。當背壓升高時,超臨界流體密度會增大,溶劑化能力增強,柱壓升高。本實驗以CO2和甲醇或異丙醇-乙醇為流動相,考察背壓在10.3～17.2 MPa范圍內(nèi)時對樣品分離的影響。結果顯示,隨著動態(tài)背壓升高,分析物保留時間減少。綜合考慮保留時間、峰形及色譜柱壓力,實驗選擇動態(tài)背壓為17.2 MPa。

隨著色譜柱溫度的升高,目標物的保留時間逐漸延長,這與傳統(tǒng)超高效液相色譜是不相同的。這是因為色譜柱溫度越高,超臨界流體密度越小,溶劑化能力降低,超臨界流體對目標化合物的溶解及交換能力可能減弱,使得目標物的保留時間增大。本實驗在保持其他色譜條件不變的前提下,在30～45 ℃范圍內(nèi)考察了柱溫對目標物分離的影響。結果顯示,三唑酮和己唑醇的最佳分離溫度為35 ℃,戊唑醇的最佳分離溫度為45 ℃,三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和腈菌唑的最佳分離溫度為40 ℃,綜合考慮6種三唑類農(nóng)藥16個對映體的分離效果及峰形,本實驗柱溫選擇40 ℃。

綜合比較了改性劑、動態(tài)背壓、溫度等影響因素,發(fā)現(xiàn)流動相中改性劑種類對6種三唑類農(nóng)藥對映體的分離效果影響最大,因此,選擇適當改性劑及其配比是獲得對映體最佳分離效果的主要手段。16種三唑類農(nóng)藥對映體標準溶液(1.2.2節(jié)中配制的20.0 mg/L)依次單獨進樣,按照上述優(yōu)化的色譜條件分析,確定16種對映體的保留時間,并建立16種對映體標準品光譜庫。6種三唑類農(nóng)藥外消旋體標準溶液(1.2.1節(jié)中配制的20.0 mg/L)依次單獨進樣,按照上述優(yōu)化的色譜條件進行拆分,如圖2所示,6種三唑類農(nóng)藥外消旋體的16個對映體均得到良好的分離。

圖2 6種三唑類農(nóng)藥對映體的拆分色譜圖

2.3 提取試劑的優(yōu)化

文獻報道中通常采用乙腈-丙酮[17]、丙酮-二氯甲烷[18]、丙酮-乙酸乙酯-正己烷[19]、乙腈[20,21]對三唑類農(nóng)藥進行提取,本文考察了這4種試劑的提取效果,結果顯示用乙腈-丙酮或丙酮-乙酸乙酯-正己烷提取時,三唑酮、三唑醇、己唑醇和腈菌唑存在基質干擾峰;用丙酮-二氯甲烷提取時,6種三唑類農(nóng)藥的色譜圖均存在基質干擾峰;而用乙腈作為提取試劑,6種三唑類農(nóng)藥的色譜圖上的基質干擾峰較少,結果與文獻報道的相符[20,21]。此外乙腈也是我國目前農(nóng)藥多殘留分析方法常用的提取溶劑[22],因此本方法選其作為提取溶劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

分別選用自制Florisil柱(10 g)、商品化Florisil柱(CNW, 5 g, 60 mL)、商品化Carb/NH2(艾杰爾,500 mg, 6 mL)3種固相萃取柱對黃瓜樣品提取溶液進行凈化試驗,外標法定量。在3份空白黃瓜樣品中分別添加0.1 mg/kg的三唑類農(nóng)藥對映體,用乙腈均質提取2次,提取液經(jīng)過GCB凈化,再分別采用3個不同固相萃取柱進行凈化,消除黃瓜本底對實驗結果的影響。實驗結果表明:3種固相萃取柱均能有效去除色素成分,用Carb/NH2復合柱凈化時,(-)-R-三唑酮、(+)-S-戊唑醇、(-)-R-戊唑醇、(-)-(S,S)-三唑醇和(+)-腈菌唑存在基質干擾峰,無法進行準確定量測定。而采用商品化Florisil柱和自制Florisil柱凈化時,16個對映體的基質干擾較小,且平均回收率分別為85%和92%。Florisil柱需要加水脫活,自制Florisil柱比較容易控制弗羅里硅土的含水量,而商品化Florisil柱的弗羅里硅土是在包裝內(nèi),每個柱子內(nèi)的弗羅里硅土含水量不同,從而導致活性不一致,在對有些活性要求高的化合物檢測時,樣品檢測的重現(xiàn)性較差。另外,市場上銷售的Florisil柱規(guī)格大多是1 g、2 g或5 g,而10 g規(guī)格的Florisil柱較少,而本實驗前處理過程中黃瓜樣品濃縮10倍,雜質含量很高,1 g、2 g或5 g規(guī)格的商品化Florisil柱的柱容量達不到凈化要求,因此必須使用10 g規(guī)格的Florisil柱。綜合考慮,最終采用自制10 g Florisil柱凈化黃瓜樣品提取液。

2.5 方法學考察

2.5.1方法的線性范圍和定量限

將16種三唑類農(nóng)藥對映體儲備液用乙腈稀釋成0、1.0、2.0、4.0、10 mg/L的標準工作溶液。在建立的分析條件下對其進行測定,以峰面積(y)對質量濃度(x)做標準曲線。結果表明,16種三唑類農(nóng)藥對映體在0～10 mg/L范圍均呈良好的線性關系,相關系數(shù)為0.999。當空白黃瓜中添加0.1 mg/kg的三唑類農(nóng)藥對映體標準溶液時,信噪比大于10,因此方法的定量限(LOQ)被定為0.1 mg/kg,而歐盟、日本、國際食品法典委員會(CAC)規(guī)定該6種三唑類農(nóng)藥在黃瓜中的限量為0.1～1 mg/kg。本方法的定量限完全能滿足黃瓜中三唑類農(nóng)藥對映體的測定要求。

2.5.2回收率和精密度

分別在空白黃瓜中添加0.1、0.2、0.5 mg/kg 3種水平的三唑類農(nóng)藥對映體進行方法學考察,按優(yōu)化條件進行提取并分析,每個添加水平平行測定6次。如表1所示,6種三唑類農(nóng)藥中16個對映體的加標回收率在65.1%～116%之間,相對標準偏差(RSD)為1.0%～9.6%。(+)-S-三唑酮、(+)-聯(lián)苯三唑醇-A、(-)-聯(lián)苯三唑醇-B、(+)-腈菌唑和(-)-腈菌唑的加標回收率符合SN/T 0001-2016[23]對回收率的要求,其他11個對映體的加標回收率不符合SN/T 0001-2016[23]對回收率的要求。雖然部分三唑類農(nóng)藥對映體的加標回收率不符合SN/T 0001-2016[23]對回收率的要求,但其相對標準偏差小,重現(xiàn)性均較好。

2.6 實際樣品檢測

從當?shù)爻?、農(nóng)貿(mào)市場上采購20批次黃瓜樣品,涵蓋本地產(chǎn)的大黃瓜和荷蘭小黃瓜兩個品種,利用所建立方法進行檢測。結果顯示,20批次黃瓜樣品均未檢出上述16種三唑類農(nóng)藥對映體。

表16種三唑類農(nóng)藥中16個對映體在黃瓜基質中的加標回收率及相對標準偏差(n=6)

Table1Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs)of16enantiomers of the six triazole pesticides in cucumber matrix(n=6)

PesticideenantiomerSpiked/(mg/kg)Recovery/%RSD/%(+)-S-Triadimefon0.181.3-92.86.60.286.9-93.84.20.587.8-98.25.7(-)-R-Triadimefon0.174.0-82.96.10.272.7-80.04.80.575.6-79.82.7(-)-(S,R)-Triadimenol0.176.6-85.25.60.274.7-89.49.40.574.4-78.62.8(+)-(R,S)-Triadimenol0.165.2-74.06.30.265.2-70.04.00.565.2-69.83.6(-)-(S,S)-Triadimenol0.169.8-83.09.30.269.1-79.87.40.571.0-80.06.4(+)-(R,R)-Triadime-nol0.168.5-79.37.60.271.6-78.44.60.571.6-75.22.5(+)-Hexaconazole0.196.0-1096.60.299.5-1167.90.595.6-1087.0(-)-Hexaconazole0.175.1-89.09.00.278.4-93.28.70.575.2-78.42.1(+)-S-Tebuconazole0.165.1-77.49.30.267.6-75.85.80.592.4-99.63.9(-)-R-Tebuconazole0.180.2-91.06.90.281.8-97.28.70.577.2-81.82.9(-)-Bitertanol-A0.173.4-87.59.60.275.8-88.37.60.575.8-79.42.4(+)-Bitertanol-A0.189.3-99.45.40.293.7-99.43.30.597.2-1053.8(-)-Bitertanol-B0.181.7-94.87.60.294.5-99.83.10.590.2-94.82.8(+)-Bitertanol-B0.175.5-84.85.80.279.6-95.59.40.575.8-79.62.6(+)-Myclobutanil0.192.9-1045.80.294.4-1045.30.598.4-1043.2(-)-Myclobutanil0.182.4-90.45.00.289.2-98.04.70.587.4-89.21.0

3 結論

通過對影響超高效合相色譜分離分析的主要因素進行優(yōu)化,建立了超高效合相色譜法拆分6種三唑類農(nóng)藥對映體的方法,以及檢測黃瓜中的6種三唑類農(nóng)藥對映體殘留的分析方法。該方法為深入分析農(nóng)產(chǎn)品 中具有功效且低毒性的對映體和無功效且高毒性的農(nóng)藥對映體殘留提供了參考，對藥物的質量控制及藥效評價具有重要的意義