圍手術(shù)期應(yīng)用烏司他丁治療對肝細胞癌患者肝切除術(shù)后外周血Th22細胞百分比和血漿白細胞介素-22的影響*

朱 俊，丁 瑩，王世清，張 野，劉 野，劉澤剛

肝切除術(shù)是治療肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最有效的方法，但手術(shù)應(yīng)激和術(shù)后炎癥反應(yīng)等均可導(dǎo)致肝臟損傷，造成術(shù)后肝腎功能異常。有研究發(fā)現(xiàn)，在圍手術(shù)期給予肝切除患者皮質(zhì)激素或烏司他丁可在一定程度上改善術(shù)后肝功能損傷[1，2]，但其機制尚未完全闡明。輔助性T細胞22（T helper 22，Th22）是新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，能分泌白細胞介素 -22（interleukin-22，IL-22），并為其主要的效應(yīng)細胞因子，在機體炎癥反應(yīng)應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用[3，4]。本研究檢測了接受肝切除手術(shù)的HCC患者外周血Th22細胞和血漿IL-22水平，為研究烏司他丁調(diào)控肝臟炎癥的機制假說提供新的試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年7月～2017年4月解放軍昆明總醫(yī)院普通外科收治的接受肝切除術(shù)治療的HCC患者88例（男62例，女26例；平均年齡為51.3±9.1歲；肝功能Child-Pugh A級47例，B級41例），符合美國肝病研究學(xué)會發(fā)布的診斷標準[5]，肝臟出現(xiàn)結(jié)節(jié)＞1 cm，在增強CT或MRI檢查時呈典型的“快進快出”征象，即動脈相顯示血管豐富，但門靜脈期消退；術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為HCC。納入標準：年齡＞18歲，Child-Pugh A級或B級，美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）活動狀態(tài)評分為0分或1分。排除標準：轉(zhuǎn)移性肝癌、術(shù)前影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)存在肝外轉(zhuǎn)移灶、有原發(fā)性腦、腎、肺重大疾病和Child-Pugh C級患者。同時，選擇30例（男22例，女8例；平均年齡為49.7±12.4歲）年齡和性別相匹配的健康志愿者為對照組。本研究方案已通過解放軍昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有入組人群簽署知情同意書。

1.2 治療方法 在88例HCC患者中，行半肝切除術(shù)治療29例，肝葉切除術(shù)治療49例，肝段切除術(shù)治療10例。所有患者均采用解剖性肝切除術(shù)，采用鉗夾法斷肝，采用Pringle手法阻斷第一肝門，控制入肝血流，肝門阻斷時間為（41.5±4.6）min。術(shù)后常規(guī)給予保肝、止血、營養(yǎng)支持、維持電解質(zhì)平衡等對癥治療。部分患者在術(shù)后，給予烏司他丁（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H19990134）30萬單位溶于50 ml生理鹽水中緩慢靜脈推注，3次/d，連續(xù)注射7 d；其余患者則不給予烏司他丁治療。

1.3 血漿IL-22水平和外周血Th22細胞檢測 采用ELISA法檢測血漿IL-22水平（使用美國R&D公司提供的試劑盒）；使用Sigma公司提供的淋巴細胞分離液和采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），調(diào)整細胞數(shù)至1×107個/管，凍存于液氮中備檢。取1×106個PBMCs，移入FACS管，加入 PMA（終濃度 5 ng/ml）、伊烏諾霉素（終濃度500 ng/ml）和莫能霉素（終濃度 10 ng/ml），于 37℃、5%CO2條件下刺激培養(yǎng) 12 h。洗滌后，加入抗人CD3-APC和抗人CD4-FITC（美國BD Bioscience公司） 各 10μl，4℃避光孵育 20 min，PBS洗滌2次，加入BD Cytofix/CytoPerm溶液200μl，室溫、避光孵育 30 min，4℃、500 g 離心 3 min，加BD Perm/Wash緩沖液洗滌2次，加入用Perm/Wash緩沖液稀釋的抗人IL-22 PerCP（美國BD Bioscience公司），冰上避光孵育30 min，加Perm/Wash緩沖液洗滌2次，加入含4%多聚甲醛的PBS固定，上FACS Calibur流式細胞儀分析。采用CellQuest Pro軟件獲取細胞，采用FlowJo8.4.2軟件分析，表型為CD3+CD4+IL-22+的細胞為Th22細胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。對于符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；對于非正態(tài)分布的計量資料以[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 在肝切除術(shù)后接受常規(guī)治療者51例，給予烏司他丁治療者37例，兩組患者人口學(xué)和臨床資料比較，無顯著性差異（P＞0.05，表1）。

表1 兩組HCC患者人口學(xué)和臨床資料【%，（±s），M（P25，P75）】 比較

表1 兩組HCC患者人口學(xué)和臨床資料【%，（±s），M（P25，P75）】 比較

常規(guī)治療（n=51） 烏司他?。╪=37）男性 34（66.7） 28（75.7）年齡（歲） 50.8±9.9 53.2±7.1 Child-Pugh A級 26（50.9） 21（56.8）Child-Pugh B級 25（49.1） 16（43.2）半肝切除術(shù) 19（37.3） 10（27.0）肝葉切除術(shù) 27（52.9） 22（59.5）肝段切除術(shù) 5（9.8） 5（13.5）肝門阻斷（min） 39.5±3.5 45.1±4.9術(shù)中出血量（ml） 420.0（300.0，2800.0） 450.0（250.0，3000.0）腫瘤直徑（cm） 4.1（1.2，11.8） 4.8（1.3，12.1）

2.2 兩組肝腎功能指標變化的比較 術(shù)前，兩組血清生化指標無顯著差異（P值均＞0.05）；術(shù)后3 d和7 d，烏司他丁治療組血清ALT和AST水平顯著低于常規(guī)治療組（P值均＜0.05，表2）。

2.3 HCC患者與健康人外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平比較 HCC患者外周血Th22百分比顯著高于健康人【（1.4±0.3）% 對（0.8±0.1）%，P＜0.0001】，HCC 患者血漿 IL-22水平亦顯著高于健康人【（116.9±32.6） pg/ml對（42.1±18.2）pg/ml，P＜0.0001】 。

2.4 兩組外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平比較 術(shù)后3 d和7 d，烏司他丁治療組外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平顯著低于常規(guī)治療組（P值均 ＜0.05，表3）。

表2 兩組血清肝腎功能指標【（±s），M(P25，P75)】 的比較

表2 兩組血清肝腎功能指標【（±s），M(P25，P75)】 的比較

與常規(guī)治療組比，①P＜0.05

常規(guī)治療（n=51） 烏司他?。╪=37）ALT（IU/L）術(shù)前 41.4（23.4，184.1） 42.1（24.1，192.3）術(shù)后 3 d 450.6（56.1，820.7） 219.4（40.1，510.9）①術(shù)后 7 d 115.4（35.7，625.2） 72.4（25.6，471.5）①AST（IU/L）術(shù)前 38.6（19.7，117.3） 40.9（15.1，109.4）術(shù)后 3d 257.3（115.3，7265） 108.8（82.5，439.1）①術(shù)后 7d 90.5（45.5，293.8） 61.4（29.4，351.4）①TBIL（μmol/L）術(shù)前 27.9±5.9 30.1±6.7術(shù)后 3d 56.1±8.3 47.7±4.9①術(shù)后7d 42.3±7.6 42.4±4.8 BUN（mmol/L）術(shù)前 4.2±1.1 4.6±1.1術(shù)后3d 4.3±1.2 4.5±1.2術(shù)后7d 4.3±0.9 4.5±0.9 Cr（μmol/L）術(shù)前 59.2±12.9 63.6±9.9術(shù)后3d 60.7±9.9 66.6±8.7術(shù)后7d 66.9±10.9 60.3±7.9

表3 兩組外周血Th22細胞（%）和血漿IL-22水平（±s）比較

表3 兩組外周血Th22細胞（%）和血漿IL-22水平（±s）比較

與常規(guī)治療組比，①P＜0.05

常規(guī)治療（n=51） 烏司他?。╪=37）外周血Th22細胞術(shù)前 1.4±0.3 1.3±0.3術(shù)后3 d 1.3±0.2 1.2±0.4術(shù)后 7 d 1.3±0.2 1.1±0.3①血漿 IL-22（pg/ml）術(shù)前 119.3±34.2 113.5±30.4術(shù)后3 d 109.7±29.8 98.1±20.1術(shù)后 7 d 110.7±37.1 94.1±24.8①

3 討論

由于術(shù)中肝臟血流阻斷和第一肝門開放造成的缺血/缺氧和再灌注，導(dǎo)致肝臟損傷和明顯的肝功能異常。同時，絕大多數(shù)HCC患者均罹患慢性肝臟疾病，如病毒性肝炎、肝硬化等，手術(shù)應(yīng)激所致的炎癥介質(zhì)釋放不但可加重肝功能損傷，還能造成腎臟、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多臟器功能不全[6]。烏司他丁是尿胰蛋白酶抑制劑，可清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放，改善免疫細胞功能，具有較強的抗炎效果，在多種危重癥患者治療中均可發(fā)揮保護肝、腎功能的作用[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組HCC患者接受肝切除術(shù)后第3天血清轉(zhuǎn)氨酶水平有所升高，至術(shù)后第7天有所下降。但烏司他丁治療組在術(shù)后第3天和第7天血清轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著低于常規(guī)治療組，但血清TBIL水平在兩組未見明顯差異，一方面說明HCC患者接受肝切除術(shù)的安全性較高，絕大多數(shù)患者未發(fā)生嚴重的肝細胞損傷；另一方面說明烏司他丁能改善患者術(shù)后肝功能狀態(tài)，有利于患者術(shù)后恢復(fù)，與既往在肝臟圍手術(shù)期應(yīng)用烏司他丁治療的結(jié)果一致[2，9]，可能與烏司他丁在一定程度上能抑制機體炎癥應(yīng)答有關(guān)[10-12]，但其中的機制仍有待進一步研究。

Th22細胞是一類新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-22和腫瘤壞死因子-α，但不表達IL-17和干擾素 -γ[3，13，14]。IL-22 是 Th22 細胞最主要的效應(yīng)細胞因子，而IL-22在多種疾病發(fā)病過程中根據(jù)其表達部位和表達量的不同可發(fā)揮促進炎癥應(yīng)答和保護細胞免受損傷的雙重作用[15]。Th22細胞及其分泌的IL-22在乙型肝炎病毒感染[16]、丙型肝炎病毒感染[17]、藥物性肝損害[18]和慢加急性肝衰竭患者[19]水平均明顯升高。動物實驗亦證實Th22細胞和IL-22在肝臟疾病發(fā)病過程中主要發(fā)揮促進炎癥應(yīng)答的作用[11]。IL-22還可促進肝癌細胞的增殖[20]，Th22細胞亦與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平顯著高于健康人，與既往的研究結(jié)果一致。加用烏司他丁治療的HCC患者在接受常規(guī)肝切除術(shù)治療后血Th22細胞和IL-22水平降低，可能與烏司他丁能抑制炎癥應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)，結(jié)合烏司他丁能降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平而表現(xiàn)出的肝臟保護作用，我們認為烏司他丁可能抑制了Th22細胞應(yīng)答。