七氟醚對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制研究*

石小龍，杜 睿，秦革萍，薛華燕，張宏鑫

膿毒癥是機(jī)體出現(xiàn)重大損傷感染后出現(xiàn)的一系列復(fù)雜的臨床病癥，是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）常遇到的疾病[1]。隨著膿毒癥病情的發(fā)展，機(jī)體各個(gè)臟器會(huì)受到不同程度的損傷，肝臟是膿毒癥最容易損傷的器官。如果肝功能不全患者發(fā)生膿毒癥會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為多臟器功能衰竭，威脅患者生命[2]。目前，對(duì)膿毒血癥發(fā)病機(jī)制的研究還在繼續(xù)。新型吸入麻醉藥七氟醚，化學(xué)名為氟甲基-六氟-異丙基醚，已被廣泛應(yīng)用于手術(shù)麻醉。有報(bào)道稱(chēng)，應(yīng)用七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但是七氟醚對(duì)膿毒癥的影響卻鮮見(jiàn)報(bào)道[3-5]。本研究制備膿毒癥肝損傷大鼠模型，探討了七氟醚對(duì)膿毒癥肝損傷大鼠肝功能的影響，為臨床廣泛應(yīng)用七氟醚麻醉提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器 60只SPF級(jí)健康雄性成年SD大鼠，體質(zhì)量為220±30 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。檢測(cè)血清ALT、AST、TBIL試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，抗-actin抗體、抗淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）和抗巨噬細(xì)胞1抗原（macrophage-1 antigen，Mac-1）抗體（Abcam）。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beyotime Biotechnology）。多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific MultiSkan Go），電泳儀電源（Tanon），相差顯微鏡（Leica）。

1.2 膿毒癥大鼠模型制備 將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組和七氟醚組。假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行開(kāi)關(guān)腹縫合手術(shù)；在膿毒癥組，采取盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立膿毒癥動(dòng)物模型；在七氟醚組，將大鼠置于密閉容器內(nèi)，一端連接麻醉機(jī)，另一端連接麻醉機(jī)檢測(cè)儀，以3 L/min的速度輸送七氟醚。當(dāng)儀器顯示七氟醚濃度達(dá)到2%后，將大鼠放入并維持30 min，再行CLP法建立膿毒癥動(dòng)物模型。術(shù)前2 h，給予戊巴比妥鈉100 mg·kg-1腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸、腹部備皮，頸部埋針用于輸液，以改良的CLP法制備大鼠膿毒癥模型，其具體的操作步驟為：在下腹部正中位置切開(kāi)約2 cm的切口，找到盲腸，并結(jié)扎盲腸根部，采用自制穿孔針在距盲腸末端1cm處戳孔，孔徑約0.5 cm，擠出糞便，結(jié)扎離斷雙側(cè)大網(wǎng)膜，采用彎針縫合腹腔。術(shù)后，立即皮下注射乳酸鈉林格液50 ml·kg-1調(diào)節(jié)體液、電解質(zhì)和酸堿平衡，所有大鼠經(jīng)靜脈給予營(yíng)養(yǎng)支持（蛋白質(zhì)含量為22.4%，脂肪含量為11.8%，碳水化合物含量為65.8%）。建立模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)到動(dòng)物全身炎性反應(yīng)綜合征的參照標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)膿毒性肝臟損傷。造模給藥結(jié)束后，處死大鼠，取肝組織，行病理學(xué)檢查。

1.3 血生化指標(biāo)檢測(cè) 自右側(cè)頸外靜脈采血1 ml，3000 r/m離心，取血清，檢測(cè)。

1.4 肝組織LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，取肝組織，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，低溫離心機(jī)4℃、12000 r/m離心10 min，收集上清液并轉(zhuǎn)移至新的EP管中，采用BCA試劑盒行蛋白定量。取蛋白樣品，用PBS稀釋?zhuān)尤?×上樣緩沖液，沸水浴5 min，自然冷卻。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。配制5%脫脂奶粉，攪拌均勻，封閉PVDF膜1 h，加一抗，4℃過(guò)夜。次日，洗去非特異性結(jié)合的抗體，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，用TPBS洗滌3次。采用ECL顯色法，在暗室中加膠片曝光，掃描，應(yīng)用Image J 2X軟件進(jìn)行蛋白條帶光密度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較先行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)方差齊性的資料采用單因素方差分析，對(duì)方差不齊的資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)情況 在光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊；膿毒癥組大鼠肝組織可見(jiàn)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉肝索排列紊亂，肝細(xì)胞水腫明顯；七氟醚組肝組織肝索排列較為整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較膿毒癥組大鼠明顯減少，提示七氟醚對(duì)大鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用（圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化情況（HE，200×）

2.2 各組大鼠血生化指標(biāo)比較 膿毒癥組動(dòng)物血清AST、ALT和 TBIL顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），而七氟醚組動(dòng)物血清AST、ALT和TBIL水平較膿毒癥組顯著下降（P＜0.05），提示七氟醚對(duì)膿毒癥引起的肝損傷有一定的保護(hù)作用（表1）。

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）比較

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）比較

與假手術(shù)組比，P＜0.05；與膿毒癥組比，P＜0.05

只 AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L）假手術(shù)組 20 67.7±11.7 45.5±9.4 1.7±0.4膿毒癥組 20 156.8±14.7 75.6±7.5 4.5±0.6七氟醚組 20 100.5±7.9 61.5±10.1 3.2±0.5

2.3 各組大鼠肝組織LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)情況 經(jīng)Western blot法檢測(cè)大鼠肝組織 LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組肝組織LFA-1和MAC-1表達(dá)均較少，膿毒癥組LFA-1和MAC-1蛋白明顯增多，而七氟醚組肝組織LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)與膿毒癥組比明顯減弱（P＜0.05，圖2，表2），上述結(jié)果表明七氟醚通過(guò)降低膿毒癥肝損傷大鼠肝組織LFA-1和MAC-1表達(dá)，從而對(duì)肝損傷起到保護(hù)作用。

圖2 各組大鼠LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)情況

表2 各組大鼠肝組織 LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)（±s）比較

表2 各組大鼠肝組織 LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá)（±s）比較

與假手術(shù)組比，P＜0.05；與膿毒癥組比，P＜0.05

LFA-1 MAC-1假手術(shù)組 20 0.2±0.1 0.2±0.1膿毒癥組 20 1.2±0.2 1.0±0.2七氟醚組 20 0.7±0.2 0.6±0.1只

3 討論

膿毒癥主要是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的全身炎癥反應(yīng)性疾病。雖然很早就被人們發(fā)現(xiàn)，但是其病理過(guò)程復(fù)雜，所以具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前主要的治療方法是控制感染源、使用抗生素以及其他的輔助療法，沒(méi)有針對(duì)性的治療方案[7-9]。七氟醚在臨床上被廣泛使用。有研究報(bào)道，七氟醚對(duì)心肌細(xì)胞有很好的保護(hù)作用，能夠明顯降低心臟病的發(fā)病率和病死率。七氟醚在神經(jīng)外科手術(shù)麻醉中的應(yīng)用價(jià)值也很突出，患者使用七氟醚后蘇醒快，術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)價(jià)恢復(fù)的時(shí)間較早，有利于早發(fā)現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥。七氟醚還有對(duì)腦血管擴(kuò)張作用弱的優(yōu)點(diǎn)，也使其應(yīng)用更為廣泛[10，11]。但是，七氟醚對(duì)膿毒癥肝損傷的研究較少，為了探討七氟醚對(duì)膿毒癥肝損傷是否有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備膿毒癥肝損傷大鼠模型，對(duì)七氟醚的作用進(jìn)行了研究。膿毒癥最易導(dǎo)致肝損傷，而肝損傷對(duì)機(jī)體有很大的危害。所以，我們首先觀察了假手術(shù)組、膿毒癥組和七氟醚組大鼠肝組織病理學(xué)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚對(duì)大鼠肝組織損傷有一定的保護(hù)作用。

LFA-1是白細(xì)胞上的重要粘附分子，是衡量炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。LFA-1屬于β2家族整合蛋白，有α鏈和β鏈兩個(gè)亞單位，分布于白細(xì)胞上，參與免疫細(xì)胞激活的殺傷效應(yīng)，還與白細(xì)胞的定位、滲出、遷移等有關(guān)。已有研究表明，LFA-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在淋巴細(xì)胞增殖、活化、遷移等活動(dòng)中有重要的作用，并且可產(chǎn)生協(xié)同刺激信號(hào)，共同影響淋巴細(xì)胞的分化和凋亡[12，13]。MAC-1位于白細(xì)胞表面，是參與機(jī)體防御作用及免疫反應(yīng)的重要的粘附分子，其粘附過(guò)程與白細(xì)胞游走滲出到炎癥部位有關(guān)。因此，MAC-1的粘附功能對(duì)炎癥的發(fā)生具有重要的意義[14]。本研究檢測(cè)了膿毒癥大鼠肝組織LFA-1和MAC-1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚有顯著的下調(diào)LFA-1和MAC-1表達(dá)的作用，可能與七氟醚緩解膿毒癥造成的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

LFA-1和Mac-1與它們的對(duì)應(yīng)受體（counterreceptors），如細(xì)胞間粘附分子（ICAM-1、ICAM-2）、連接粘附分子（junctional adhesion molecules，JAM-A、JAM-C）和高級(jí)糖化端產(chǎn)物（advanced glycation end products，RAGE）受體對(duì)中性粒細(xì)胞聚集起非常重要的促進(jìn)作用。這個(gè)瀑布過(guò)程中潛在的配體特異性結(jié)合機(jī)制仍然不明[15，16]。多形核白細(xì)胞（PMN）從血液循環(huán)聚集到感染部位或無(wú)菌傷口，表現(xiàn)出很多效應(yīng)細(xì)胞的功能，如吞噬、脫顆粒、釋放中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘導(dǎo)劑（neutrophil extracellular traps，NETs）等，成為機(jī)體抵御入侵病原體和組織損傷防御的第一防線(xiàn)。通常，白細(xì)胞聚集瀑布是一個(gè)多步驟的過(guò)程，包括捕獲、滾動(dòng)、慢滾、制動(dòng)（硬粘附）、粘附加強(qiáng)和擴(kuò)散、腔內(nèi)爬行、細(xì)胞旁或跨細(xì)胞遷徙等。除了選擇素介導(dǎo)的捕獲和滾動(dòng)外，兩個(gè)β2整合素成員，LFA-1和Mac-1以及它們的對(duì)應(yīng)受體在促進(jìn)接下來(lái)的白細(xì)胞聚集瀑布過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LFA-1和Mac-1是表達(dá)于白細(xì)胞表面的α、β異質(zhì)二聚體的跨膜糖蛋白。除了它們常見(jiàn)的內(nèi)皮配體ICAM-1 and ICAM-2外，另在內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了JAM-A、JAM-C和RAGE也是它們的配體。JAM-A直接與LFA-1而不是與Mac-1發(fā)生作用，而JAM-C和RAGE直接與Mac-1而不是LFA-1作用。因此，就PMN聚集而言，必須從生理學(xué)的角度才能闡明配體特異性的β2整合素功能[17]。

大量的研究證據(jù)表明PMN聚集呈組織和刺激特異性，主要依賴(lài)于β2整合素和它們的各種各樣的配體的表達(dá)和功能發(fā)揮。一方面，LFA-1 and Mac-1在不同組織與它們的對(duì)應(yīng)配體呈現(xiàn)出特質(zhì)的功能，如在肌肉組織，LFA-1和Mac-1功能各異，即LFA-1負(fù)責(zé)介導(dǎo)初始的粘附，而Mac-1接管后來(lái)的腔內(nèi)爬行。然而，LFA-1-ICAM-1和Mac-1-RAGE合作作用介導(dǎo)創(chuàng)傷誘發(fā)的白細(xì)胞粘附、爬行和遷徙。在肝竇，Mac-1在PMN粘附和爬行方面占主導(dǎo)，而LFA-1只輕微地影響爬行速率。相反，Mac-1只是通過(guò)IL-10選擇性地下調(diào)內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，引起整合素非依賴(lài)的，CD44依賴(lài)的肝內(nèi)PNM聚集。另一方面，在各種生理刺激下，β2整合素的相同配體可能作用不同。例如，在肌肉微環(huán)境中，在IL-1β誘導(dǎo)，而不是MIP-2誘導(dǎo)的PMN爬行過(guò)程中需要ICAM-2的協(xié)助。JAM-C過(guò)表達(dá)能通過(guò)IL-1β刺激肌肉小靜脈PNM粘附和遷徙。這些看似矛盾的觀察結(jié)果主要是由于組織或刺激特異性的LFA-1或 Mac-1與它們的多種配體之間的相互作用及分子表達(dá)和分布主導(dǎo)著血流中內(nèi)皮內(nèi)PMN的作用強(qiáng)度、爬行和遷徙速度[18-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚可以通過(guò)下調(diào)炎癥相關(guān)因子LFA-1和MAC-1表達(dá)對(duì)膿毒癥造成的肝損傷起到保護(hù)作用，而應(yīng)用七氟醚行各類(lèi)大型手術(shù)的麻醉具有重要的臨床意義。