燈盞花素對肝臟缺血再灌注損傷大鼠肝臟和腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用*

林秋香，王雪雯，黃祖雄，潘 晨

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指組織在一定時(shí)間內(nèi)缺血，恢復(fù)供血后組織受到損傷加重的現(xiàn)象[1]。在大多數(shù)情況下，動物器官缺血后再灌注可以使得組織器官功能得到恢復(fù)，受到損傷的結(jié)構(gòu)也得到恢復(fù)，但肝臟缺血一段時(shí)間后重新恢復(fù)血流會發(fā)生損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。研究表明能量代謝障礙、氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、中性粒細(xì)胞活化并釋放炎性細(xì)胞因子等均為影響IRI程度的重要因素[2]。燈盞花素（erigeron breviscapus）又名燈盞細(xì)辛，主要有效成分為黃酮類[3，4]。經(jīng)過成分鑒定，燈盞花素中的燈盞乙素含量約為95%，主要從短亭飛蓬中提取而來。有研究表明，燈盞花素可以有效減少血小板凝聚、改善心腦血管血流量、抵抗自由基的氧化作用[5，6]。燈盞花素可以有效地保護(hù)肝臟，其主要機(jī)理為其能清除氧自由基、降低血漿纖維蛋白原含量和促進(jìn)纖溶酶活性，改善微循環(huán)。燈盞花素對腸IRI有明顯的保護(hù)作用，主要是其能改善腸粘膜微循環(huán)障礙，從而能保護(hù)腸黏膜屏障功能[7，8]。本研究觀察了燈盞花素對大鼠肝臟IRI和腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級6周齡雌性大鼠45只，體質(zhì)量為200±30 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2017-0022，普通級，分9籠飼養(yǎng)于本院動物中心實(shí)驗(yàn)室?？傄谎趸∟O）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 肝臟缺血再灌注損傷模型的制備[9]隨機(jī)將大鼠分為對照組、模型組和燈盞花素干預(yù)組，每組15只。術(shù)前3 d，給予模型組和對照組動物生理鹽水5 ml·kg-1經(jīng)尾靜脈注射，在燈盞花素干預(yù)組，給予燈盞花素5 mg.·kg-1尾靜脈推注。給予模型組和燈盞花素處理組大鼠3%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，正中切口進(jìn)腹，解剖肝門，用無創(chuàng)動脈夾夾閉肝臟左、中葉門靜脈和肝動脈分支，制造約70%肝臟缺血模型。60 min后，松開動脈夾，進(jìn)行再灌注120 min；在對照組，以相同的手術(shù)方法切開顯露門靜脈和肝動脈，但不夾閉血管。參照前期研究，制備腸I/R模型[10]。在模型組大鼠和燈盞花素干預(yù)組，給予10%水合氯醛溶液3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉，手術(shù)、分離腸系膜上動脈（SMA），使用微動脈夾，造成腸缺血模型，45 min后松開動脈夾，進(jìn)行再灌注 60 min。

1.3 血漿內(nèi)毒素檢測 取大鼠血漿100μL，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒（美國Sigma公司）說明書操作步驟檢測。

1.4 大鼠腸黏膜分泌型（S）IgA及腸組織誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、NO、TNF-α和IL-1β水平檢測 刮取腸黏膜，溶于PBS（pH 7.4）2 mL中制成懸液，采用ELISA 法（購自美國R&D Systems公司）檢測SIgA水平。取大鼠腸組織，溶于PBS（pH 7.4）2 mL中制成懸液，采用ELISA檢測NOS（上海仁捷生物科技有限公司）、NO（上海齊一生物科技有限公司）、TNF-α和IL-1β（武漢華聯(lián)科有限公司）。

1.5 腸黏膜屏障功能檢測 取大鼠靜脈血2μL，2000 r/m離心后，吸收上層血清，采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清降鈣素原（PCT）水平（試劑盒購自武漢佰奧達(dá)生物科技有限公司）；采用活性比色法檢測血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平（ 試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司）。

1.6 大鼠肝組織Toll樣受體-4（TLR4）和核因子（NF）-κB表達(dá)水平檢測 采用Western blot法，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對定量分析。以TLR4和NF-κB蛋白條帶與 β-actin灰度比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件處理和分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸粘膜SIgA和血漿指標(biāo)比較 與對照組比，模型組大鼠腸黏膜SIgA含量顯著下降（P＜0.01）；大鼠血漿內(nèi)毒素、PTC和DAO水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比，燈盞花素干預(yù)組大鼠SIgA含量顯著升高，而內(nèi)毒素、PTC和DAO水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表1）。

表1 大鼠腸粘膜SIgA、血漿內(nèi)毒素、PTC和DAO水平（±s）比較

表1 大鼠腸粘膜SIgA、血漿內(nèi)毒素、PTC和DAO水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

DAO（Ku/L）對照組 0.7±0.1 0.2±0.1 3.5±0.98 6.5±1.2模型組 0.2±0.1① 0.8±0.1① 5.0±1.2① 10.5±1.6①燈盞花素 0.7±0.1② 0.3±0.1② 3.9±1.0② 7.5±1.3②SIgA（μg/kg）內(nèi)毒素（EU/ml）PTC（ng/ml）

2.2 大鼠腸組織iNOS、eNOS和NO水平比較 與對照組比，模型組大鼠腸組織iNOS含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而eNOS和和總NO含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比，燈盞花素干預(yù)組大鼠腸組織iNOS含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而eNOS和總NO含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表2）。

2.3 大鼠肝組織TLR4和NF-κB及血漿TNF-α和IL-1β水平比較 與對照組比，模型組大鼠肝組織 TLR4和 NF-κB及血漿 TNF-α 和 IL-1β水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比，燈盞花素處理組大鼠肝組織 TLR4和NF-κB及血漿TNF-α和IL-1β水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表3）。

表2 大鼠腸組織iNOS、eNOS 和NO 水平（±s）比較

表2 大鼠腸組織iNOS、eNOS 和NO 水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

iNOS（U/g） eNOS（U/g） NO（μmol/g）對照組 0.2±0.1 0.4±0.1 0.4±0.0模型組 0.7±0.1① 0.2±0.1① 0.2±0.1①燈盞花素 0.3±0.1② 0.8±0.2② 0.8±0.1②

表3 大鼠肝臟組織TLR4、NF-κB及血漿TNF-α和 IL-1β（±s）比較

表3 大鼠肝臟組織TLR4、NF-κB及血漿TNF-α和 IL-1β（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

IL-1β（mg/g）對照組 0.3±0.1 0.5±0.1 10.2±1.2 0.5±0.1模型組 1.3±0.2① 1.3±0.2① 15.5±1.1① 1.3±0.1①燈盞花素 0.3±0.1② 0.7±0.1② 11.8±0.2② 0.6±0.1②TLR4 NF-κB TNF-α（pg/ml）

3 討論

由于肝臟缺血再灌注后肝功能反復(fù)出現(xiàn)異常，會使得腸道系統(tǒng)存在慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜屏障保護(hù)功能受到嚴(yán)重影響，滲透性程度明顯增加，阻隔內(nèi)毒素的功能顯著性降低。當(dāng)腸道內(nèi)毒素水平過高會導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，進(jìn)一步加重肝功能損害和腸黏膜屏障功能紊亂的嚴(yán)重程度[11]。本研究發(fā)現(xiàn)使用燈盞花素處理后大鼠血漿內(nèi)毒素水平顯著降低，說明燈盞花素可以有效緩解大鼠腸道損傷。有研究表明[12，13]，eNOS催化產(chǎn)生的NO對腸黏膜屏障功能有保護(hù)作用，缺血再灌注損傷會促使炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)iNOS表達(dá)增加，導(dǎo)致NO合成增加，在這種情況下iNOS催化產(chǎn)生的NO被認(rèn)為對腸黏膜屏障功能有損傷作用。有研究發(fā)現(xiàn)[14-16]，腸黏膜屏障功能損傷后，大量NO與超氧化物自由基反應(yīng)產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽，并發(fā)生亞硝化反應(yīng)，促使NO含量增加，加重缺血再灌注對腸黏膜屏障功能的損害。燈盞花素處理可激活eNOS/NO通路、增加腸黏膜SIgA表達(dá)、使得大鼠血漿內(nèi)毒素含量減少，減輕腸黏膜損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在使用燈盞花素處理后，大鼠腸黏膜SIgA和體內(nèi)內(nèi)毒素顯著降低，說明燈盞花素有效地改善了腸黏膜屏障功能。大鼠體內(nèi)eNOS/NO含量也顯著上升，說明燈盞花素有效地激活了eNOS/NO通路，達(dá)到對腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用，這與先前的研究結(jié)論相一致。

PCT是無生理學(xué)活性功能的降鈣素前肽。當(dāng)腸黏膜屏障保護(hù)系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害時(shí)會促進(jìn)內(nèi)毒素的分泌和釋放，這些內(nèi)毒素會導(dǎo)致 PCT合成分泌量迅速升高，使得血清 PCT平顯著性升高。血漿PCT水平可準(zhǔn)確反映腸黏膜屏障功能損傷的嚴(yán)重程度[18]。DAO則是一種腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)酶，腸黏膜上皮受到嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，會分泌DAO并釋放入腸間隙和血液循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致血漿DAO水平顯著升高，故DAO水平可準(zhǔn)確反映腸黏膜組織結(jié)構(gòu)和生理功能狀態(tài)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)使用燈盞花素處理后，大鼠血漿PCT和DAO水平顯著降低。

NF-κB是一種真核轉(zhuǎn)錄因子，其作用和分布都十分廣泛，有研究表明其參與各種炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)控[20]。在肝臟缺血再灌注過程中NF-κB調(diào)控的炎癥因子有TNF-α、IL-1β、IL-1和IL-6等。燈盞花素預(yù)處理可以通過抑制NF-κB的表達(dá)，下調(diào)炎癥因子分泌，達(dá)到緩解肝臟IRI的加重。TLRs是近年發(fā)現(xiàn)的一類模式識別受體（pattern recognition receptor），主要有 TLR1-TL9，其中 TLR-4 主要存在于肝臟細(xì)胞，是一種跨膜蛋白。有研究表明，TLR-4含量的增加會使IRAK4磷酸化，激活TRAF6，導(dǎo)致NF-κB活化，促使 TNF-α、IL-1β、IL-1和 IL-6表達(dá)，加重肝臟IRI。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在使用燈盞花素處理的大鼠，體內(nèi)NF-κB顯著下降，相應(yīng)的炎癥因子含量也顯著下降，有效地緩解了大鼠肝臟IRI。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)燈盞花素處理組大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-1β含量顯著下降，這一結(jié)果也證明了藥物處理大鼠體內(nèi)NF-κB和TLR-4含量確實(shí)下降了，因而肝臟缺血再灌注損傷也得到了顯著的改善。