射干種子萌發(fā)特性及對干旱脅迫的響應

(內蒙古農業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院/農業(yè)部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室/ 草地資源教育部重點實驗室， 呼和浩特 010010)

germination potential

射干(IrisBelancandachinensis(L.) DC.)是鳶尾科(Iridaceae)射干屬(BelamcandaAdans)的多年生草本植物，具有重要的觀賞價值，也是人們所熟知的中藥材，以根狀莖入藥，具有清熱解毒，利咽消痰，散血消腫的作用[1]。射干在生態(tài)習性上對溫度、光照和干旱等外界環(huán)境的適應性極強[2]。

朱金英[3]和崔曉敬[4]等分別對射干的栽培技術進行了詳細的總結歸納。而在中草藥層面，針對射干治療哮喘的研究尤為突出[5]。隨著射干需求量的增加，野生射干資源呈減少趨勢，已不能滿足人類需要[6]。前人對射干繁殖更新方面的研究較少，且鮮見對其種子萌發(fā)特性方面的研究。在我國北方城市，如內蒙古自治區(qū)呼和浩特市，屬溫帶大陸性季風氣候，其主要特點是光照充足，且降水少。干旱會導致植物的繁殖更新受到限制，因此本研究一方面要探究射干種子的萌發(fā)特性，另一方面要摸清射干種子對干旱的響應，以求解決射干引種馴化中的擴繁問題，且為其繁殖更新提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用種子2017年10月采集于呼和浩特市郊區(qū)合創(chuàng)農業(yè)開發(fā)園區(qū)引種圃中的射干植株。在收獲及清選后將粒大飽滿的種子置室溫下干燥貯藏，萌發(fā)試驗于2018年3—5月在內蒙古農業(yè)大學草地資源教育部重點實驗室等地點進行。

1.2 試驗方法

1.2.1種子形態(tài)特征

選取發(fā)育良好且成熟飽滿的種子置于顯微鏡下，觀察種子顏色、性狀及表面紋飾等基本特征，并以拍照記錄。試驗采用千粒法，隨機數取3份1 000粒的供試種子，分別使用精度為萬分之一的天平進行稱重，取其平均值即為種子的千粒重。

1.2.2種子適宜萌發(fā)溫度條件的篩選

通過預實驗得知，室溫干燥貯藏的射干種子幾乎不存在休眠。試驗在人工培養(yǎng)箱中進行，設置恒溫10，15，20，25，30，35 ℃及變溫20/30 ℃共6個溫度處理，每個處理設置3個重復，每重復隨機數取50粒種子，采用紙上發(fā)芽方式，以2層潤濕的濾紙作為發(fā)芽床進行發(fā)芽試驗。每隔24 h澆適量的水使發(fā)芽床保持濕潤狀態(tài)，并記錄其發(fā)芽數直至無萌發(fā)種子出現為止。

參照《國際種子檢驗規(guī)程》[7]及我國《牧草種子檢驗規(guī)程》[8]，將種子新鮮胚根伸出超過種子長度以上視為發(fā)芽，以便對種子發(fā)芽情況進行統計，每天記錄發(fā)芽的種子數直至無萌發(fā)種子出現為止。

根據發(fā)芽試驗記錄的數據按公式計算各相關發(fā)芽指標如下：

發(fā)芽率[9]=(n/N)×100%

式中，n為最終達到的正常發(fā)芽種子數，N為供試種子數;

發(fā)芽指數[9]=∑Gt/Dt

式中，Gt為在t日內發(fā)芽數，Dt為發(fā)芽日數；

發(fā)芽勢[9]=(n*/N)×100%

式中，n*為發(fā)芽實驗初期種子發(fā)芽數，N為供試種子數；

相對發(fā)芽率(%)=(脅迫處理的發(fā)芽率/對照的發(fā)芽率)×100%；

胚根/胚芽=胚根長度/胚芽長度；

萌發(fā)脅迫指數[10]=脅迫下種子發(fā)芽指數/對照種子發(fā)芽指數；

萌發(fā)抗旱指數[11]=脅迫下種子萌發(fā)指數/對照種子萌發(fā)指數；

種子萌發(fā)指數=(1.00)Rd 2+(0.75)Rd 4+(0.5)Rd 6+(0.25)Rd 8

式中,Rd 2,Rd 4,Rd 6,Rd 8分別為第2,4,6,8天的種子發(fā)芽率。各種相對指標均為干旱脅迫處理與對照的比值。

1.2.3發(fā)芽過程中對光的反應

在篩選出最適的發(fā)芽溫度條件下，于人工培養(yǎng)箱中進行2種光照對比發(fā)芽試驗。發(fā)芽床采用2層濕潤濾紙的紙上發(fā)芽。光照處理將人工培養(yǎng)箱光強調至33%，黑暗處理為不透光牛皮紙遮于培養(yǎng)皿外側。每個處理設置3個重復，每重復隨機選取50粒種子。每天記錄種子發(fā)芽數、霉爛數，及時補充水分保持發(fā)芽床濕潤。測定指標同1.2.2。

表3 不同濃度PEG處理對射干種子萌發(fā)指標的影響

PEG濃度/%發(fā)芽率/%發(fā)芽勢/%發(fā)芽指數相對發(fā)芽率萌發(fā)脅迫指數萌發(fā)抗旱指數071.11b48.89b2.99b1.00b1.00b1.00a587.78a52.22a3.58a1.23a1.20a0.98b1060.00c44.44c2.84c0.84c0.95c0.85c1525.56d12.22d1.22d0.36d0.41d0.72d202.22e0.00e0.06e0.03e0.02e0.00e

1.2.4發(fā)芽對干旱脅迫耐性研究

室溫條件下，選取粒大飽滿的射干種子，用蒸餾水沖洗干凈，采取聚乙二醇溶液(PEG-6000)模擬干旱脅迫，設0%(對照)、5%、10%、15%、20%共5個不同濃度溶液去代替清水培養(yǎng)液，將種子置于墊2層濾紙的發(fā)芽床上作為紙上發(fā)芽。每處理3個重復，每個重復50粒種子。每天記錄種子的發(fā)芽及發(fā)霉腐爛的種子數，并及時補充培養(yǎng)液。測定指標同1.2.2。

1.3 數據處理

采用Excel 2016軟件進行試驗數據統計及作圖，用SAS 9.0中Duncans檢驗樣本間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 射干種子形態(tài)特征

射干種子呈近球形，長約2 mm，寬約0.5 mm，千粒重為(9.099±0.201)g，種皮呈現黑棕色，表面光滑，有光澤。

2.2 種子發(fā)芽最適溫度的確定

在自然光照的情況下，設置了不同的溫度梯度對射干種子進行萌發(fā)試驗。以發(fā)芽率，發(fā)芽指數和發(fā)芽勢作為測定指標。在不同溫度條件下，射干種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數3個指標表現顯著性差異。由表1可知，恒溫10 ℃、30 ℃及35 ℃均不利于射干種子萌發(fā)，發(fā)芽率最低且與其他溫度條件的發(fā)芽率存在顯著性差異；恒溫25 ℃發(fā)芽率雖優(yōu)于上述3個溫度處理，但仍顯著低于20 ℃和25 ℃恒溫條件及20 ℃/30 ℃變溫條件下的發(fā)芽率，3種溫度條件下的發(fā)芽率分別高達92.22%、97.78%及94.33%。進一步結合發(fā)芽指數指標來看，恒溫20 ℃處理顯著高于其他溫度條件，為3.77，變溫20 ℃/30 ℃次之，達3.67。但再結合發(fā)芽勢看來，恒溫25 ℃下的種子發(fā)芽勢僅為40.00%，顯著低于恒溫20 ℃。篩選種子最適溫度條件時，發(fā)芽率可作為首要考慮指標。但綜合其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數3個指標后，最終確定射干種子最適萌發(fā)溫度為恒溫20 ℃。

表1 自然光照條件下，不同溫度對射干萌發(fā)的影響

溫度/℃發(fā)芽勢/%發(fā)芽率/%發(fā)芽指數100.00c12.22c0.31d1537.78b92.22a3.09b2064.44a97.78a3.77a2540.00b57.78b1.87c301.11c2.22d0.2d350.00c0.00d0.00d20/3060.56ab94.33a3.67ab

注：表中同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.3 光照條件對種子發(fā)芽的影響

在篩選出的最適溫度條件下進行黑暗條件下的萌發(fā)試驗，以自然光為對照。從表2可以看出，自然光照下射干種子的3個發(fā)芽指標均顯著高于黑暗條件下的值。黑暗條件下的發(fā)芽率極低，僅為36.00%。由此可知，光照條件對于射干種子的發(fā)芽影響極大。

表2 20 ℃條件下，2種不同的光照條件對射干種子發(fā)芽指標的影響

光照發(fā)芽勢%發(fā)芽率%發(fā)芽指數黑暗條件27.00b36.00b1.15b自然光64.44a97.78a3.77a

2.4 種子發(fā)芽對PEG脅迫的耐性

2.4.1PEG處理對種子萌發(fā)指標的影響

通過0%、5%、10%、15%及20% 5個濃度的PEG處理，射干種子在萌發(fā)過程中表現出了較明顯的差異。如表3所示，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、相對發(fā)芽率以及萌發(fā)脅迫指數在5%PEG下均明顯高于對照，發(fā)芽率可高達87.78%；當PEG濃度為10%及以上時，萌發(fā)指標在數值上開始發(fā)生了明顯的降低。而萌發(fā)抗旱指數則隨著PEG濃度的增加而呈現下降的趨勢。萌發(fā)抗旱指數可表征種子在萌發(fā)過程中抗旱時間的長短，PEG濃度的升高可以明顯縮短種子的抗旱時間。綜合來看，低濃度的干旱脅迫可以在一定程度上促進種子的萌發(fā)。

2.4.2種子發(fā)芽率與PEG濃度的關系

當種子發(fā)芽率分別下降到50%和25%時，所對應的干旱脅迫作為種子萌發(fā)的臨界值和極限值[12]。對發(fā)芽率和PEG濃度進行相關分析可知，二者呈明顯的負相關關系。因此用一元線性回歸對方程進行擬合，可預測出射干種子在抵抗干旱脅迫時的臨界值為10%(實際值為9.8%)，以及極限值為15%(實際值為16.1%)。

圖1 種子發(fā)芽率與PEG濃度之間的線性關系

2.4.3PEG處理對種子胚根長以及胚芽長的影響

根系的發(fā)達程度可以表征植物的抗旱能力。如圖2 A所示，射干種子的胚根長隨著PEG濃度的升高而表現出逐漸降低的趨勢，對照的胚根長為32.56 mm，20% PEG處理下胚根長為0 mm；胚根的不斷降低說明其長度與干旱程度之間存在著負相關關系。

而從圖2 B中可以看出，隨著PEG濃度的升高，種子的胚芽呈先升高后降低的變化趨勢。顯示出低水平的干旱會促進胚芽的伸長，而高水平的干旱程度則會對種子胚芽的伸長起到抑制作用。胚芽在5%處理下達到最大值，為2.78 mm，方差分析顯示，明顯高于對照，當PEG濃度升至10%，胚芽的伸長被明顯抑制，低于對照，且當PEG濃度逐漸升高，胚芽長會呈更明顯的下降趨勢，當PEG濃度為20%時，胚芽的伸長完全被抑制。

如圖3所示，隨著PEG濃度的升高，胚根/胚芽呈明顯的下降趨勢，對照的胚根/胚芽明顯高于其他處理，可見干旱脅迫對射干種子胚根的影響抑制作用顯著高于胚芽。

2.5 種子發(fā)芽計數時間的確定

在上述試驗所篩選出射干最適的發(fā)芽條件，即恒溫20 ℃，自然光條件下去觀察種子的發(fā)芽情況。在整個萌發(fā)試驗過程中，置種第5天即有種子萌發(fā)，當發(fā)芽持續(xù)到第8天時，有超過60%的種子萌發(fā)。因此，推薦將射干種子初次計數時間定為置種的第8天。同時第12天后再無新種子有發(fā)芽動勢。綜合考慮其它環(huán)境條件可能對種子發(fā)芽產生的影響，推薦將射干末次計數時間延緩至置種后第15天。

圖2 PEG濃度對射干種子胚根及胚芽長度的影響

圖3 PEG處理對種子胚根/胚芽比值的影響

3 討 論

溫度作為種子萌發(fā)的先決條件，對植物萌發(fā)過程的影響也很顯著。試驗結果顯示，射干種子以恒溫20 ℃為分界線，過低與過高溫度條件都會對種子萌發(fā)表現出不同程度的影響。恒溫10 ℃、30 ℃及35 ℃的3個發(fā)芽指標均顯著低于恒溫20 ℃的處理。15 ℃與20/30 ℃處理雖發(fā)芽率不顯著低于20 ℃處理，但因其發(fā)芽勢較低，即發(fā)芽速度慢且發(fā)芽不整齊，故該溫度處理不建議被用作射干的最適萌發(fā)溫度。25 ℃雖是室溫，也是大量種子萌發(fā)的最適溫度[13-15]，但射干在該溫度下，3個發(fā)芽指數均表現不優(yōu)。因此推薦射干種子的最適萌發(fā)溫度為恒溫20 ℃。

光照對種子萌發(fā)的影響不止體現在復雜的生理過程上，同時也是受到調控的信號傳遞和基因表達過程[16]。種子根據對光照的需要與否，分為需光種子、嫌光種子[17]。本試驗結果表明，光照對射干種子的正面影響十分顯著，然而該種子在黑暗情況下發(fā)芽率極低，且發(fā)芽高峰期滯后，可見適當的增加光照對種子萌發(fā)具有一定的促進作用?？蓪⑸涓煞N子歸為需光種子。關于光照對射干種子萌發(fā)的研究尚未可見，但本試驗結果與樊璐等[18]對有髯鳶尾研究結果不盡相同。

種子萌發(fā)對干旱環(huán)境的響應反映了植物種子適應逆境的能力[19]。利用PEG溶液模擬土壤干旱水平，可達到方便易操作的目的。試驗采用4種不同PEG溶液濃度與清水作對比，結果顯示，各個濃度PEG溶液處理均對射干種子萌發(fā)過程產生了不同程度的延緩作用?？傮w來看，隨著PEG濃度的升高，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數、相對發(fā)芽率、萌發(fā)脅迫指數呈先升高后下降趨勢，在5%PEG處理下以上指標達到最大值，而當PEG濃度逐漸上高至10%時，以上萌發(fā)指標則呈顯著的降低趨勢，可見低水平的干旱可以促進射干種子萌發(fā)而高水平的干旱會抑制其萌發(fā)；萌發(fā)抗旱指數表征種子在抵抗干旱時間上的長短，隨著PEG濃度的增加，該指標呈明顯下降的趨勢，說明干旱會明顯的縮短射干種子抗旱時間，其關鍵原因是由于環(huán)境中水勢降低，導致細胞失水，細胞代謝活動下降所致[20]。其中，20%濃度PEG處理的種子明顯出現受抑制狀態(tài)，發(fā)芽率僅為2.22%，說明射干種子能正常萌發(fā)的臨界水分脅迫在PEG濃度為20%以下(相當于-0.6 MPa水勢[21])。對射干種子的發(fā)芽率與PEG濃度之間的相關關系進行一元回歸方程的擬合，得出該種子所能抵抗干旱的臨界值為PEG濃度10%(相當于-0.2 MPa水勢[21])，而極限值為15%(相當于-0.4 MPa水勢[21])，該處理下的射干種子的發(fā)芽率明顯降低，發(fā)芽高峰期也有所滯后，評價種子發(fā)芽水平的首要指標是發(fā)芽率，因此可以看出，15%的PEG溶液對射干的萌發(fā)過程已產生一定程度的負面影響。綜合來看，射干種子對干旱脅迫有一定的忍耐能力。這一結論與李燕[22]的研究結果相仿。

4 結 論

射干種子最適的萌發(fā)溫度為恒溫20 ℃，屬于需光種子；隨著PEG濃度的升高，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、相對發(fā)對率、萌發(fā)脅迫指數、胚芽長均呈現先升高后降低的趨勢，且在5%PEG下達到最大值，即低干旱水平可促進種子萌發(fā)及抗旱能力，高干旱水平會起到抑制作用；隨著PEG濃度的升高，萌發(fā)抗旱指數、胚根長明顯降低，即該兩種指標與PEG濃度呈負相關關系；胚根/胚芽亦會隨著PEG濃度升高而增大，即干旱脅迫對胚根的抑制作用會顯著高于對胚芽的影響。用一元線性回歸擬合種子發(fā)芽率和PEG濃度，預測出射干種子所能抵御的水分滲透勢臨界值為-0.2 MPa，極限值為-0.4 MPa。推薦射干種子萌發(fā)初次計數時間為置床后的第8天，末次計數時間為置床后的第15天。