免疫組化篩查林奇綜合征的缺陷和應(yīng)對策略

高顯華 張衛(wèi) 白辰光

林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）是由于錯配修復(fù)基因的胚系突變引起的，是最常見的遺傳性結(jié)直腸癌綜合征，約占所有結(jié)直腸癌的3%。引起LS的錯配修復(fù)基因（mismatch repair，MMR）包 括 MLH1（MutL Homolog 1）、MSH2（mutS homolog 2）、MSH6（mutS homolog 6）和 PMS2（PMS1 homolog 2）等。此外，EPCAM（epithelial cell adhesion molecule）基因的胚系突變可以引起MSH2基因的啟動子甲基化，從而引起MSH2蛋白質(zhì)的表達缺失，進而引發(fā)LS。LS患者患多種癌癥的風(fēng)險顯著增加，包括結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、輸尿管癌、腎盂癌、膽道癌和腦腫瘤［1］。準確識別LS，對LS患者及親屬進行相應(yīng)的篩查和監(jiān)測，對于防治LS相關(guān)的癌癥至關(guān)重要。

一、LS的篩查方案

目前，LS的篩查方案主要有兩類：第一類方案是對存在高危因素的人群行免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測是否存在錯配修復(fù)蛋白缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）［2］，或者行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）檢測；第二類篩查方案是普查，即所有初診的結(jié)直腸癌患者均進行dMMR或MSI檢測。第一類方案主要包括各種LS的篩查標準和預(yù)測模型，通過收集患者的病史、腫瘤史、家族史和腫瘤的病理形態(tài)特征來預(yù)測LS的風(fēng)險。比如：阿姆斯特丹Ⅰ（Amsterdam Ⅰ）標準、阿姆斯特丹Ⅱ標準、貝塞斯達（Bethesda）標準、修訂版的貝塞斯達標準、中國人LS家系篩查標準、PREMM5模型［3］、MMR predict模型和MMR pro模型。符合上述篩查標準或者預(yù)測LS的風(fēng)險＞5%的結(jié)直腸癌患者建議行dMMR或者MSI檢測，如有異常再行MMR基因的胚系突變檢測，進而確診有無LS。由于生育的子女數(shù)目變少，現(xiàn)在的家庭成員比過去少；而且，還有許多患者提前接受了結(jié)腸鏡檢查和預(yù)防性息肉切除術(shù)，因此通過癌癥的家庭和個人病史無法可靠地檢測出所有的LS患者。一些病理組織學(xué)特征，包括淋巴細胞浸潤腫瘤上皮、黏液腺癌、印戒細胞癌、髓樣癌、低分化腺癌和克羅恩病樣瘤周淋巴細胞反應(yīng)，可以提示高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）和LS，但是敏感性和特異性并不強。事實上，約有50%的LS患者并不符合阿姆斯特丹標準和貝塞斯達標準。LS預(yù)測模型的敏感性和特異性較各種篩查標準略高，但是仍有較高的漏診率。而且，準確地收集個人史和家族史有時非常困難，又非常耗時，難以在繁忙的臨床實踐中進行推廣。鑒于上述原因，近年來，針對所有結(jié)直腸癌的LS普查方案逐漸得到了國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的一致認同。

二、LS的普查

目前，有多個權(quán)威的國際組織推薦對所有初診的結(jié)直腸癌患者進行LS的普查，包括美國腫瘤綜合協(xié)作網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）［4］、美國胃腸病學(xué)會（American College of Gastroenterology，ACG）［5］、美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）［6］、Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention［7］、美國多社會工作組（US Multi-Society Task Force）［8］和 National Institute for Health and Care Excellence（NICE）［9］。臨床實踐證明，LS的普查具有成本效益［1］，并有助于為患者及其親屬制定合適的終身篩查方案。此外，dMMR和MSI檢測對散發(fā)性結(jié)直腸癌也很重要，首先dMMR/MSI-H的發(fā)生率高達15%～20%，伴有dMMR/MSI-H的癌癥對5-FU反應(yīng)不佳，適合行抗PD-1和PD-1L的免疫治療。LS的普查方案包括IHC檢測dMMR和MSI檢測兩種，前者由于具有經(jīng)濟實惠、對檢測設(shè)備的要求低、便于基層醫(yī)院開展和可以提示突變基因等優(yōu)點，成為LS篩查的首選。但是，IHC篩查LS也存在很多問題，如果不加以質(zhì)控，容易引起LS的漏診和誤診。本文將對IHC篩查LS存在的問題和解決方案做一簡要綜述。

三、IHC檢測dMMR的病理報告

美國病理學(xué)會建議dMMR的檢測報告采用“表達缺失”和“表達正?！钡姆诸惙椒?；不推薦“陰性”和“陽性”，因為容易帶來誤解。很多人可能認為“陰性”是正常的，而實際上“陰性”的結(jié)果提示可能為LS。對于IHC不能確定的病例，推薦報告為“建議進一步檢查（包括重復(fù)染色、取放療前活檢標本染色、行MSI檢測、行基因的胚系突變檢測）”［10］。如果使用“陰性”和“陽性”來報告dMMR的結(jié)果，則建議在報告中備注“陰性為表達缺失，提示可能為LS；陽性為表達正?！?，以免引起患者的誤解。

四、錯配修復(fù)蛋白（MMR蛋白）在結(jié)直腸癌組織中的正常染色情況

正常情況下，四種MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）在結(jié)直腸癌細胞的細胞核中染色，同時自身內(nèi)對照（組織內(nèi)部的淋巴細胞和正常腸黏膜上皮細胞）的細胞核也有染色。通常大多數(shù)結(jié)直腸癌細胞核（＞50%）都能被染色，而且染色強度相當于（甚至高于）自身內(nèi)對照細胞［11］。

五、四種MMR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的常見染色形式和原因

MMR蛋白的常見染色形式可以通過其生物學(xué)功能來解釋。4種MMR蛋白形成2個異二聚體復(fù)合物，即MLH1-PMS2和MSH2-MSH6，進而促進DNA的錯配修復(fù)。PMS2和MSH6都需要和它們的配體結(jié)合，然后才能形成穩(wěn)定的異二聚體。因此，MLH1突變時常常表現(xiàn)為MLH1和PMS2同時表達缺失，而MSH2突變則常常引起MSH2和MSH6同時表達缺失。然而，由于MLH1和MSH2都可以與其他蛋白質(zhì)形成異二聚體；因此，當PMS2或MSH6突變時，MLH1和MSH2仍然可以穩(wěn)定存在，表現(xiàn)為染色正常（表1）。

六、四種MMR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的罕見染色形式和原因

除了上述5種常見的染色形式，偶爾還會出現(xiàn)一些罕見的情況（表2）。雖然這些情況很少見，但是熟悉這些罕見情況可以解釋很多臨床上的難題和困惑，所以專門從事遺傳咨詢的醫(yī)師應(yīng)予以重視。

七、dMMR檢測篩查LS對組織樣本的要求

在臨床實踐中，推薦使用“手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標本”檢測dMMR。在某些特殊情況下，手術(shù)切除的腸癌標本不可獲取，那么也可以選擇活檢結(jié)直腸癌標本、腺瘤性息肉和轉(zhuǎn)移癌的標本。如果用活檢標本和其他標本，可能會引起一些問題，分析時應(yīng)予以重視（表3）［10］。

八、MMR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的異常染色情況

以下染色模式被認為是異常的，需要進行進一步檢查：斑片狀核染色、胞漿染色、核膜染色和核仁染色。斑片狀染色很常見，可能與組織缺氧和固定條件變異有關(guān)［12］。有人認為，如果超過5%的腫瘤細胞核顯示明確的核染色，則將其視為錯配修復(fù)蛋白完整（proficient mismatch repair, pMMR）；反之，則為錯配修復(fù)蛋白缺陷（dMMR）。一些研究者使用不同的臨界值，例如大于10%［13］，大于1%，或任何程度的令人信服的染色［10］。還有學(xué)者提出，盡管MMR蛋白可能會出現(xiàn)表達變異；但大多數(shù)病例呈彌漫陽性，并顯示超過50%的腫瘤細胞核染色［11］。如果染色的腫瘤細胞核小于50%，則可能為dMMR，要引起重視。如果檢測到可疑染色，則需要進一步檢查，包括重復(fù)染色、選擇另一個蠟塊、選擇另一個樣本（如用直腸癌新輔助放化療前的活檢標本）或其他檢測（MSI或基因突變檢測）［11］。

表1 免疫組化檢測dMMR的常見表現(xiàn)形式和原因［11］

表2 免疫組化檢測dMMR的罕見表現(xiàn)形式和解釋［11］

表3 免疫組化檢測dMMR篩查LS：檢測樣本的缺陷［11］

九、可能干擾MMR蛋白的IHC讀片的兩種病理形態(tài)特征

另外，還有兩種特殊情況可能會干擾MMR蛋白的IHC讀片。第一種是大量淋巴細胞浸潤腫瘤上皮，此時淋巴細胞的染色可能被誤認為是腫瘤細胞的染色［11］。第二種是印戒細胞癌，印戒細胞癌的癌細胞核很小，而且胞漿無染色，所以印戒細胞的細胞核和正常的內(nèi)對照細胞（淋巴細胞、正常腸黏膜上皮細胞）的細胞核容易混淆，進而干擾讀片，要引起重視。一般來說，腫瘤細胞核比背景淋巴細胞更大，形態(tài)更不規(guī)則［11］。

十、林奇樣綜合征（Lynch like syndrome）

林奇樣綜合征的定義為：結(jié)直腸癌患者的IHC結(jié)果顯示為dMMR，但是卻沒有檢測到MMR基因或EPCAM基因的胚系突變。如果腫瘤檢測結(jié)果為MLH1表達缺失，則還需要排除BRAF V600E突變或MLH1啟動子甲基化［14-15］。林奇樣綜合征的發(fā)生率很高，大約占dMMR病例（排除MLH1甲基化）的56%～71%［15］。引起的林奇樣綜合征的可能原因包括：

（1）雙重體細胞突變［16-17］；（2）IHC 結(jié)果的讀片錯誤（假陽性病例）；（3）未使用目前最新的檢測手段來檢測MMR基因的胚系突變（例如：未采用MLPA技術(shù)檢測基因的大片段缺失，許多商業(yè)實驗室未檢測MSH2外顯子1-7的反轉(zhuǎn)，普通的二代測序難以檢測出PMS2的突變）；（4）其他基因的胚系突變也可引起MSI，如雙等位基因 MUTYH 突變［18］；（5）體細胞鑲嵌［19］；（6）MLH1組成性表觀突變（MLH1啟動子區(qū)的胚系單等位基因超甲基化；MLH1的基因序列沒有改變）［20］。

因此，林奇樣綜合征由多種原因引起，其中大多數(shù)與胚系突變和家族性癌癥風(fēng)險無關(guān)。分析清楚他們的原因，盡量減少使用含糊不清的術(shù)語“林奇樣綜合征”，是LS篩查工作的一項重要內(nèi)容。

十一、MMR蛋白IHC結(jié)果解讀的常見錯誤

理想情況下，MMR蛋白在大多數(shù)結(jié)直腸癌細胞的細胞核（＞50%）中染色，而且染色強度相當于甚至高于自身內(nèi)對照細胞［11］。但是，由于腫瘤的異質(zhì)性、組織固定、染色技術(shù)、抗體質(zhì)量和新輔助放化療等因素的干擾，可能會出現(xiàn)異常的染色情況，導(dǎo)致結(jié)果誤讀。本文將針對這些誤讀的原因和解決辦法逐一進行闡述（表4）。

1. 誤將胞漿染色判讀為“表達正?！保ū?）：錯配修復(fù)蛋白在增殖細胞的細胞核中表達，包括癌細胞、正常的腸黏膜上皮細胞和淋巴細胞。因此，只應(yīng)評估核染色，胞漿染色可能反映了強背景染色，并且可能非常強，以至于會模糊細胞核，此時不應(yīng)給予判讀，建議重新染色。如果重新染色后仍然存在很強的胞漿染色，建議進一步檢查（如MSI）［21］。

2. 腫瘤細胞核染色強度比自身對照弱，將腫瘤誤判為“表達正?！保ū?）：有時，MMR蛋白在腫瘤細胞核中的染色強度與淋巴細胞或腸黏膜上皮細胞等正常內(nèi)對照細胞核的染色強度不同。腫瘤細胞核染色與內(nèi)部對照相似或更強的病例很容易被解釋為表達正常。腫瘤細胞核的弱染色或不染色，伴隨自身對照的弱染色或不染色；這種情況不應(yīng)進行判讀，建議重新染色。如果重復(fù)行IHC后對照仍為陰性，則應(yīng)考慮行MSI檢測。值得注意的是，一些dMMR的結(jié)直腸癌并不是完全沒有腫瘤細胞核染色。腫瘤細胞核的弱或可疑染色伴隨著內(nèi)對照細胞的強染色也可能是dMMR。這種情況建議重新染色，如果結(jié)果相似，則建議進一步檢查。

3. 將異質(zhì)性的染色歸因于IHC染色的失?。耗[瘤的異質(zhì)性染色可能是由于技術(shù)問題，這種情況往往伴隨內(nèi)對照細胞的不染色。然而，有些病例顯示腫瘤染色缺失區(qū)域與腫瘤染色正常區(qū)域交替，同時內(nèi)對照的染色正常。在某些情況下，具有不同染色模式的腫瘤區(qū)域顯示出獨特的形態(tài)變化；而在另一些情況下，在形態(tài)相似的區(qū)域中出現(xiàn)不同的染色模式。這種異質(zhì)性可以反映腫瘤內(nèi)亞克隆之間的分子變異。這些癌癥一般不存在dMMR，也沒有基因的胚系突變［22］。在一些情況下，由于抗體擴散到組織中的不均勻性，導(dǎo)致組織外圍的染色比組織內(nèi)部的腫瘤細胞核更深。雖然活檢標本的染色模式通常與手術(shù)切除標本有著良好的相關(guān)性，但腫瘤異質(zhì)性可能是小活檢標本的潛在問題［23］。

4. 將直腸癌放化療后的染色弱或核仁染色誤判為“染色缺失”（表4）：新輔助放化療后的直腸癌可能幾乎完全喪失MSH6染色或僅有核仁染色［24-25］；新輔助放化療后，約30%的直腸癌出現(xiàn)PMS2染色減弱［26］。這些病例大多沒有基因的胚系突變。如果染色模棱兩可，取放化療前的活檢標本進行IHC染色通常可以解決這個問題。

5. 夸大LS的可能性：過去認為，所有與MLH1啟動子甲基化無關(guān)的dMMR都是由LS引起的，即使沒有檢測到MMR基因的胚系突變?；颊吆陀H屬均被建議終身隨訪監(jiān)測?，F(xiàn)在很清楚，這種情況叫林奇樣綜合征，是由多種原因引起，其中大多數(shù)與胚系突變和LS無關(guān)，需引起重視。

表4 免疫組化檢測dMMR篩查LS：結(jié)果誤讀的原因和解決辦法［11］

6. 誤以為IHC結(jié)果為pMMR即可排除LS：MMR基因的一些胚系突變可能產(chǎn)生一些無功能的蛋白質(zhì)，但是卻保留其抗原性。在少數(shù)情況下，LS是由能夠損害蛋白質(zhì)功能的錯義突變引起的，但這種錯義突變卻未能引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。這種錯義突變的結(jié)果就蛋白質(zhì)功能喪失，但是卻保留了完整的與抗體結(jié)合的抗原表位（表2）。這種LS患者具有dMMR的機制和表型，并且發(fā)生各種癌癥的風(fēng)險升高，但其腫瘤的IHC檢測結(jié)果為pMMR。因此，對臨床疑似的LS患者，即使IHC檢測結(jié)果為pMMR，也應(yīng)進行MSI或者基因的胚系突變檢測。

7. 將不尋常的模式歸因于免疫組化染色的失?。ū?）：如果4種MMR蛋白都為腫瘤細胞染色缺失，則應(yīng)觀察內(nèi)對照細胞有無染色，如果內(nèi)對照細胞也無染色，可能為組織固定或IHC技術(shù)問題導(dǎo)致的染色失敗。如果內(nèi)對照染色正常，而腫瘤細胞所有4種MMR蛋白均染色缺失，這種模式歸因于MSH2的胚系突變（導(dǎo)致MSH2和MSH6表達缺失）和MLH1的甲基化（導(dǎo)致MLH1和PMS2表達缺失）［27］。另一種不尋常的模式是MLH1和PMS2染色與MSH6染色的完全缺失或者異質(zhì)性缺失。MSH6染色的克隆丟失可以通過位于MSH6編碼區(qū)中的單核苷酸重復(fù)的二級突變來解釋。由于MLH1缺陷導(dǎo)致的MSI在MSH6中引起繼發(fā)性突變，使其從表達中沉默［28］。如果內(nèi)對照細胞染色完整，那么這些染色缺失就不應(yīng)被視為IHC的技術(shù)失敗。

8. 誤以為腺瘤與腺癌樣本在篩查LS方面完全等同（表3）：LS的IHC篩查首選腺癌組織，但有時也會選擇腺瘤。除了MMR極其罕見的雙等位基因胚系突變（組成性錯配修復(fù)缺陷）之外，LS絕大多數(shù)情況下是由于雜合的胚系突變引起的。因此，LS中的腺瘤可能還沒有獲得導(dǎo)致MMR表達缺失的第二突變。研究發(fā)現(xiàn)LS患者中，66%的腺瘤顯示dMMR，在大腺瘤（＞5 mm）中百分比更高（88%）［29］。伴有高度不典型增生、絨毛狀組織或大于10 mm的腺瘤更可能發(fā)生第二次突變，導(dǎo)致dMMR［30-31］。因此，LS患者的腺瘤可能為pMMR；當腺瘤組織檢測結(jié)果為pMMR時，并不能排除LS。

9. 使用無蒂鋸齒狀腺瘤來篩查LS或幫助鋸齒狀息肉的分型：不應(yīng)使用無蒂鋸齒狀腺瘤來篩查LS。腺瘤是LS的癌前病變，而鋸齒狀腺瘤（或鋸齒狀息肉）不是LS的癌前病變［32］。一些鋸齒狀腺瘤通過散發(fā)性BRAF突變和MLH1甲基化而沿著鋸齒狀途徑演變?yōu)槲⑿l(wèi)星不穩(wěn)定癌。然而，除非等到鋸齒狀腺瘤變得發(fā)育不良，否則鋸齒狀腺瘤一般不會出現(xiàn)dMMR。檢測MMR蛋白表達也不能用于鋸齒狀腺瘤的分類。

10. 即使重復(fù)染色后，腫瘤和內(nèi)對照均無染色，也不考慮組成性的錯配修復(fù)缺陷（constitutional mismatch repair deficiency，CMMRD）：染色或組織固定的技術(shù)問題，是腫瘤細胞和內(nèi)對照細胞均出現(xiàn)染色缺失的最可能的原因。然而，由于MMR的雙等位基因胚系突變，這也可以在CMMRD中看到。在這種情況下，外部陽性對照仍會染色，并可能提示組織存在問題或CMMRD［33］。因此，如果內(nèi)對照細胞在重復(fù)IHC后未能染色，則應(yīng)推薦對其他組織進行檢測和/或進行基因突變檢測。這種罕見的CMMRD應(yīng)包括在這些案例的鑒別診斷中。

十二、小結(jié)

大約15%的結(jié)直腸癌為dMMR。其中大多數(shù)（12%）是散發(fā)的，3%是由于MMR基因的胚系突變引起的，即LS。對LS患者及親屬進行適當?shù)暮Y查和監(jiān)測，可以早期發(fā)現(xiàn)癌癥甚至預(yù)防癌癥的發(fā)生。目前，多個國際組織推薦所有初診的結(jié)直腸癌進行LS的篩查，IHC檢測dMMR已被廣泛用于LS的篩查。由于技術(shù)問題以及不尋常的染色模式，IHC染色結(jié)果可能出現(xiàn)各種誤判。干擾IHC染色結(jié)果解釋的因素包括：細胞漿染色、內(nèi)對照細胞染色弱甚至無染色、腫瘤細胞的異質(zhì)性、特殊的病理形態(tài)表現(xiàn)（如：淋巴細胞浸潤腫瘤上皮、印戒細胞癌）、新輔助放化療、檢測樣本和罕見染色模式。避免IHC的各種解讀陷阱對于準確識別LS至關(guān)重要，有助于減輕患者和親屬的醫(yī)療費用和焦慮。同時，由于采用IHC進行LS的普查本身還存在一些固有缺陷，所以不能將IHC作為LS的唯一篩查手段，應(yīng)綜合應(yīng)用各種篩查標準、IHC、MSI、BRAF V600E突變、MLH1啟動子甲基化和基因的胚系突變檢測，以便對LS做出準確的診斷。