貝參特牌西洋參三七膠囊對(duì)氫化可的松所致免疫低下小鼠的影響

袁小平，謝 勇，劉 焱，蒲學(xué)明，于曉風(fēng)，李沅耕，睢大筼*

（1.吉林省北域西洋參研究有限公司，長春130000；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春130021）

貝參特牌西洋參三七膠囊（APC）是利用西洋參提取物、三七粉和靈芝破壁孢子粉組方研制的一種用于提高免疫力的保健食品。西洋參（PanaxquinquefoliumL.）為五加科人參屬植物，原產(chǎn)于美國和加拿大，國內(nèi)多個(gè)地區(qū)已廣泛種植。研究表明，西洋參莖葉皂苷通過增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有免疫增強(qiáng)與調(diào)節(jié)作用，可能與促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ表達(dá)有關(guān)[1]。西洋參水煎液可顯著提高小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度和單核吞噬細(xì)胞能力[2]。 三七 [Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科植物三七的干燥根和根莖。研究表明，三七水煎劑可提高單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的活性，對(duì)SRFC和PFC均有促進(jìn)作用[3]。三七皂甙在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和NK細(xì)胞等方面具有明顯的增強(qiáng)作用[4]。破壁靈芝孢子粉能提高細(xì)胞免疫力和體液免疫力，提高免疫球蛋白和補(bǔ)體的含量，誘導(dǎo)干擾素的生成，激活自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)免疫器官胸腺、脾臟、肝臟的重量，從而增強(qiáng)人體對(duì)各種疾病的抵抗能力[5，6]。本文觀察APC對(duì)小鼠特異性及非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)ICR雄性小白鼠，體重18.0～22.0g，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2007-0003。實(shí)驗(yàn)溫度為 24℃， 濕度為60%。

1.2 藥品與細(xì)胞

西洋參三七膠囊由吉林省北域西洋參研究有限公司提供，批號(hào)：20190815；氫化可的松（2mL/支），河南潤弘制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1704171；Yac-1小鼠淋巴瘤細(xì)胞系細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組給藥及模型建立

200只清潔級(jí)ICR雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及西洋參三七膠囊（APC）低、中、高劑量組，每組40只。對(duì)照組及模型組每日灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉20ml/kg，藥物組分別灌胃給予APC 0.25、0.5、1.0g/kg，每日1次，連續(xù)灌胃30天。除對(duì)照組外，各組均于給藥第24、26、28、30天皮下注射氫化可的松40 mg/kg，建立小鼠免疫功能低下模型。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)

2.2.1 小鼠抗體生成能力實(shí)驗(yàn)

于給藥第27天，各組10只小鼠腹腔注射5%（v/v）雞紅細(xì)胞懸液0.2mL進(jìn)行免疫，第31天，眼球取血，1500 r/min離心5min，取血清，用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋后的血清0.5mL與5%（v/v）雞紅細(xì)胞懸液0.25mL，10%（v/v）補(bǔ)體 0.25mL 混勻，于恒溫箱中 37°C孵育30min，置4°C冰箱中30min終止反應(yīng)。1500 r/min離心5min，取上清液200μL加入平底96孔板中，在酶標(biāo)儀540nm下測(cè)OD值。另設(shè)不加血清的空白孔作為對(duì)照孔，以O(shè)D值作為判定血清溶血素水平的指標(biāo)。

2.2.2 小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力實(shí)驗(yàn)

于第31天，各組10只小鼠眼球取血，2000 r/min離心10 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清中TNF-α、IL-6含量。無菌取脾，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞濃度為1×107/ml脾細(xì)胞懸液。在平底96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μl上述細(xì)胞懸液。每只小鼠設(shè)3副孔，加100μl 1640培養(yǎng)液。另設(shè)ConA刺激3副孔，每孔加入100μl上述脾細(xì)胞懸液及100μlConA（終濃度為 5μl/ml）。 置于 37°，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育44h后每孔加入MTT 10μl（終濃度5mg/ml），繼續(xù)置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。棄上清，每孔加入DMSO 100μl，微型震蕩器震蕩至結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀570nm長下測(cè)量OD值，計(jì)算刺激指數(shù)SI。SI=刺激孔OD值/對(duì)照孔OD值。

2.2.3 小鼠NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

于第31天，各組10只小鼠無菌取脾，制成脾細(xì)胞懸液。取處于對(duì)數(shù)生長期的靶細(xì)胞Yac-1細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。U型96孔板中，試驗(yàn)孔加入細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液100μL，每只小鼠設(shè)3復(fù)孔，加入靶細(xì)胞Yac-1細(xì)胞懸液100μL。另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔3復(fù)孔，加入細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液100μL及RPMI1640培養(yǎng)液100μL。設(shè)靶細(xì)胞Yac-1細(xì)胞對(duì)照孔3復(fù)孔，加100μL靶細(xì)胞懸液及RPMI1640培養(yǎng)液，37℃孵育4 h后，1000 r/min離心5 min，每孔棄上清液100μL，加入MTT溶液10 μL，置于37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育結(jié)束后2500 r/min離心5 min，棄上清。每孔加入DMSO 100μL，微型振蕩器振蕩至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀570 nm下讀數(shù)，計(jì)算NK細(xì)胞活性，以殺傷率表示。殺傷率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值）/靶細(xì)胞 OD 值]×100%。

2.2.4 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)

于第31天，各組10只小鼠尾靜脈注射用生理鹽水稀釋10倍的印度墨汁0.1 mL/10g，分別于注射后1 min及5 min從小鼠內(nèi)眥靜脈采血20μL，溶于2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中，以酶標(biāo)儀680 nm處測(cè)量OD值。并于第二次采血后脫臼處死小鼠，取胸腺、脾臟和肝臟準(zhǔn)確稱重，以胸腺、脾臟和肝臟重量（mg）/體重（10g）計(jì)算胸腺、脾臟和肝臟系數(shù)，按下列公式計(jì)算吞噬指數(shù)k和吞噬活性a。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析進(jìn)行均值比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±S表示，采用組間比較t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠臟器系數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠臟器系數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬能力均明顯降低 （P＜0.01）。與模型組比較，APC 0.5、1.0g/kg均能明顯提高小鼠胸腺和脾臟系數(shù)，增強(qiáng)吞噬指數(shù)K和吞噬活性α（P＜0.05 或P＜0.01），0.25g/kg組對(duì)小鼠胸腺、肝臟和脾臟系數(shù)，吞噬指數(shù)K和吞噬活性 α 均無明顯影響（P＞0.05），結(jié)果見表 1、2。

表1 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n=10）

與對(duì)照組比較 ##P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01

images/BZ_5_1636_2264_1656_2283.pngimages/BZ_5_1891_2264_1909_2283.pngimages/BZ_5_2123_2264_2142_2283.pngimages/BZ_5_1621_2314_1640_2333.pngimages/BZ_5_1897_2314_1917_2333.pngimages/BZ_5_2120_2314_2139_2333.pngimages/BZ_5_1636_2364_1656_2383.pngimages/BZ_5_1892_2364_1911_2383.pngimages/BZ_5_2123_2364_2143_2383.pngimages/BZ_5_1633_2414_1653_2433.pngimages/BZ_5_1888_2414_1907_2433.pngimages/BZ_5_2123_2414_2143_2433.pngimages/BZ_5_1633_2464_1653_2483.pngimages/BZ_5_1888_2464_1907_2483.pngimages/BZ_5_2123_2464_2142_2483.png

表2 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s，n=10）

表2 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s，n=10）

與對(duì)照組比較 ##P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01

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2.2 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性及血清溶血素的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，NK細(xì)胞殺傷率及血清溶血素生成OD值均明顯降低（P＜0.01）。 與模型組比較，APC 0.5、1.0g/kg 能明顯提高小鼠T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，NK細(xì)胞殺傷率及血清溶血素生成OD值 （P＜0.05或P＜0.01），0.25g/kg對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性及血清溶血素生成均無明顯影響（P＞0.05），結(jié)果見表3。

表3 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK 細(xì)胞及溶血素的影響（±s，n=10）

表3 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK 細(xì)胞及溶血素的影響（±s，n=10）

與對(duì)照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

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2.3 對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠血清TNF-α及IL-6含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α及IL-6水平均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，APC 0.5、1.0g/kg均能明顯提高免疫功能低下小鼠血清TNF-α及 IL-6 水平（P＜0.05 或P＜0.01），0.25g/kg對(duì)小鼠小鼠血清TNF-α 及IL-6水平均無明顯影響 （P＞0.05），結(jié)果見表4。

表4 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠血清TNF-α 及IL-6含量的影響 （±s，n=10）

表4 APC對(duì)氫化可的松致免疫低下小鼠血清TNF-α 及IL-6含量的影響 （±s，n=10）

與對(duì)照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

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3 討論

免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。中樞免疫器官包括胸腺和骨髓，外周免疫器官包括脾臟、淋巴結(jié)和黏膜免疫系統(tǒng)。胸腺、脾臟可最直觀地體現(xiàn)機(jī)體的免疫功能。當(dāng)病原體進(jìn)入并攻擊人體后，巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞會(huì)釋放細(xì)胞因子來刺激適應(yīng)性免疫的激活[7]。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖并分化成能夠消除病原體的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，這樣免疫系統(tǒng)可以在病原體再次攻擊時(shí)產(chǎn)生更快速、有效的反應(yīng)[8]。NK細(xì)胞是參與固有免疫的重要成員，無需預(yù)先致敏即可破壞受損的細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，應(yīng)答速度快，在免疫應(yīng)答早期即可發(fā)揮作用[9]。在抗原進(jìn)入機(jī)體并被免疫系統(tǒng)識(shí)別后，可從淋巴細(xì)胞抗原受體庫中將結(jié)構(gòu)與其互補(bǔ)的細(xì)胞克隆挑選出來，并進(jìn)一步激活，從而產(chǎn)生特異性抗體，而通過對(duì)抗體生成能力進(jìn)行檢測(cè)，即可評(píng)價(jià)相應(yīng)的體液免疫功能[10]。當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后部分小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不成熟的母細(xì)胞，進(jìn)行有絲分裂發(fā)生母細(xì)胞增殖反應(yīng)，可使用MTT比色法檢測(cè)母細(xì)胞的增殖率來表示T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能[11]。本研究結(jié)果表明，APC可明顯提高氫化可的松致免疫功能低下小鼠脾臟和胸腺的臟器系數(shù)，增強(qiáng)免疫功能低下小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高NK細(xì)胞的殺傷活性、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及血清溶血素和TNF-α和IL-6細(xì)胞因子水平，提示其可有效增強(qiáng)固有免疫、適應(yīng)性免疫應(yīng)答強(qiáng)度，提高細(xì)胞因子水平，對(duì)小鼠非特異性及特異性免疫功能均具有增強(qiáng)作用。