羥氯喹與貝伐單抗協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞生長的作用及機(jī)制

宣自學(xué)，楊 慧，葉 強(qiáng)，張 夙，石佳娜，王 維，張國兵，邵燕飛，王如意，方晴霞

(浙江省人民醫(yī)院，杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310014)

腫瘤血管為腫瘤提供了氧分、營養(yǎng)和散播途徑，靶向腫瘤血管可以達(dá)到“餓死”腫瘤的治療效果[1]。貝伐單抗(bevacizumab，BEV)能夠特異性地靶向血管內(nèi)皮生長因子VEGF-A，抑制血管新生和腫瘤生長[2]。但是，腫瘤血管新生涉及到多個(gè)蛋白或信號(hào)通路，單靶藥物抑制某一蛋白后，血管生成往往出現(xiàn)代償性現(xiàn)象，進(jìn)而引起腫瘤反彈性生長、轉(zhuǎn)移以及耐藥[3]。臨床上在使用貝伐單抗時(shí)，往往需要與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用，以提高對(duì)腫瘤的抑制作用。

細(xì)胞自噬能夠通過降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)以及入侵的微生物等，來維持腫瘤的穩(wěn)態(tài)，因此，抑制細(xì)胞自噬可以阻滯腫瘤的進(jìn)展[4]?？汞懰幜u氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)可抑制自噬體與溶酶體的融合及降解，從而抑制細(xì)胞自噬[5]。羥氯喹目前主要用于風(fēng)濕免疫性疾病的治療，近年來，它的抗腫瘤作用逐漸被揭示[6]。但是，羥氯喹的抗腫瘤作用機(jī)制非常復(fù)雜，目前報(bào)道的作用機(jī)制有：抑制細(xì)胞自噬、影響溶酶體功能、調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)、影響內(nèi)涵體功能、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增敏放化療等。

有研究提示，貝伐單抗與羥氯喹聯(lián)用可以協(xié)同抑制多種腫瘤的生長[7]。然而，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用對(duì)腫瘤血管的作用及機(jī)制尚不明確。由于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)在血管新生過程中發(fā)揮重要作用，也常被用于腫瘤血管新生的實(shí)驗(yàn)，因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(real time cellular analysis，RTCA)和流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)，分別研究羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，然后利用體外血管形成實(shí)驗(yàn)，研究羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用對(duì)HUVEC細(xì)胞血管形成的作用。此外，本實(shí)驗(yàn)擬通過Western blot檢測(cè)LC3、p62蛋白的表達(dá)，電鏡觀察自噬體和線粒體變化，以及利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)進(jìn)一步闡明羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用，協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞生長的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，購自美國ScienCell實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2藥物與試劑 Matrigel膠(BD公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone)；貝伐單抗(羅氏公司)；羥氯喹(Sigma-Aldrich)；LC3抗體(Cell Signaling Technology)；p62抗體(Abcam公司)；Annexin V-FITC試劑盒(Kengen)；xCElligence RTCA S16(艾森生物)；RTCA板(艾森生物)；胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco)。

1.1.3儀器 LSM880激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss)；H-7650透射電子顯微鏡(日立)；流式細(xì)胞儀(Millipore)；xCELLigence RTCA S16(ACEA Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1RTCA實(shí)驗(yàn) 首先，在E-Plate板的孔中加入50 μL培養(yǎng)基，并放置在RTCA Station上。RTCA自動(dòng)掃描，并開始檢測(cè)基線，以確定所選擇的孔接觸正常。等待所有孔的基線處于40～120之間后，取出E-Plate板，并且在孔中加入100 μL HUVEC細(xì)胞懸液(3 000個(gè)/孔)[13]。隨后，分別加入羥氯喹(5 mg·L-1)、貝伐單抗(100 mg·L-1)、羥氯喹(5 mg·L-1)聯(lián)合貝伐單抗(100 mg·L-1)。將E-Plate板放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中的RTCA Station上，系統(tǒng)會(huì)檢測(cè)細(xì)胞Cell Index值[8]。

1.2.2流式凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，離心，并收集細(xì)胞。將HUVEC細(xì)胞(2.5×108·L-1)接種至6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中過夜。分別加入羥氯喹(5 mg·L-1)、貝伐單抗(100 mg·L-1)、羥氯喹(5 mg·L-1)聯(lián)合貝伐單抗(100 mg·L-1)處理，48 h后收集細(xì)胞。經(jīng)1×PBS清洗、離心及收集細(xì)胞后，加入300 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。然后將5 μL的Annexin V-FITC加入細(xì)胞懸液，混勻后室溫避光孵育20 min。最后加入5 μL的PI，混勻后室溫避光孵育5 min，補(bǔ)加200 μL的1×Binding Buffer后，流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3血管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)期的HUVEC細(xì)胞離心，然后將HUVEC細(xì)胞(6.0×106·L-1)，加入提前鋪好Matrigel基質(zhì)膠的96孔板，并且按要求加入不同濃度的藥物。培養(yǎng)12 h后，各組細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，并采用Leica Application Suite軟件照相(×100)，分析各組細(xì)胞血管形成能力[9]。

1.2.4Western blot檢測(cè)p62、LC3的表達(dá) 收集羥氯喹(5 mg·L-1)、貝伐單抗(100 mg·L-1)、羥氯喹(5 mg·L-1)聯(lián)合貝伐單抗(100 mg·L-1)處理的HUVEC細(xì)胞，PBS清洗1次，加入蛋白解裂解液，然后置于冰上裂解細(xì)胞，并且4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝于1.5 mL離心管中，并置于-80 ℃保存。BCA蛋白濃度檢測(cè)，計(jì)算樣品的蛋白濃度。然后經(jīng)過制膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜，最后將PVDF膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。照片以TIF格式導(dǎo)出后，在ImageJ軟件下分析各條帶光密度[10-11]。

1.2.5透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 將羥氯喹(5 mg·L-1)、貝伐單抗(100 mg·L-1)、羥氯喹(5 mg·L-1)聯(lián)合貝伐單抗(100 mg·L-1)處理的HUVEC細(xì)胞樣本用細(xì)胞刮刀刮下，PBS清洗3遍后，加入2.5%戊二醇，4 ℃過夜，利用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.6LC3雙熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染觀察自噬實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，胰酶消化后，800 r·min-1離心5 min，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107·L-1，鋪24孔板，爬片。每孔均加入1 mL，放入培養(yǎng)箱中靜置過夜。d 2換1% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入mCherry-EGFP-LC3紅綠雙熒光質(zhì)粒，d 3加入羥氯喹(5 mg·L-1)、羥氯喹(5 mg·L-1)聯(lián)合貝伐單抗(100 mg·L-1)，24 h后多聚甲醛固定15 min，熒光顯微鏡下拍照、分析。

1.2.7RNA-seq測(cè)序 本實(shí)驗(yàn)中，我們首先提取各組細(xì)胞的總RNA，然后通過質(zhì)量檢測(cè)、分選純化mRNA及片段化、合成第一鏈cDNA、第二鏈cDNA等過程后，分步進(jìn)行雙鏈cDNA末端修復(fù)反應(yīng)和3’末端加“A”反應(yīng)。然后，按照操作流程，加入連接緩沖液和雙鏈測(cè)序接頭，利用T4 DNA連接酶將illumina測(cè)序接頭連接至文庫DNA兩端。應(yīng)用Agencourt SPRIselect核酸片段篩選試劑盒在純化文庫的同時(shí)，對(duì)片段大小進(jìn)行篩選。再利用PCR擴(kuò)增DNA文庫，并對(duì)文庫的質(zhì)量檢測(cè)后，利用Illumina Hiseq平臺(tái)，以2×150 bp雙端測(cè)序模式進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得FastQ數(shù)據(jù)。最后整理原始數(shù)據(jù)、過濾及質(zhì)量評(píng)估，整理參考基因組注釋信息，比對(duì)到參考基因組及結(jié)果評(píng)估等，并且進(jìn)行mRNA表達(dá)定量分析、mRNA差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析[12]，研究羥氯喹聯(lián)合貝伐單抗抑制HUVEC細(xì)胞生長的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用，協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞增殖利用RTCA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HUVEC細(xì)胞的Cell Index值。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，羥氯喹、貝伐單抗組細(xì)胞的Cell Index值降低，提示羥氯喹、貝伐單抗均對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖有抑制作用。與單藥組相比，羥氯喹和貝伐單抗聯(lián)合給藥Cell Index值更低，抑制作用更強(qiáng)(Fig 1A)。

2.2 羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用，協(xié)同促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡利用Annexin V-FITC流式凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羥氯喹(5 mg·L-1)、貝伐單抗(100 mg·L-1)能夠明顯促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡，并且羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用后，凋亡的比例增加，提示羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用能夠協(xié)同促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡(Fig 1B、1C)。

2.3 羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用，協(xié)同抑制HUVEC體外血管狀結(jié)構(gòu)形成如Fig 2所示，羥氯喹(5 mg·L-1)、貝伐單抗(100 mg·L-1)均能夠抑制HUVEC體外血管狀結(jié)構(gòu)形成，當(dāng)貝伐單抗與羥氯喹聯(lián)用后，血管狀結(jié)構(gòu)形成抑制作用更明顯。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用可以協(xié)同抑制HUVEC體外血管狀結(jié)構(gòu)形成。

2.4 羥氯喹可以抑制HUVEC細(xì)胞自噬LC3主要以胞質(zhì)和胞膜結(jié)合的兩種狀態(tài)存在，一種是彌散的胞質(zhì)狀態(tài)的LC3-Ⅰ，一種是膜結(jié)合狀態(tài)的LC3-Ⅱ。在自噬誘導(dǎo)時(shí)，LC3-Ⅰ的C端在ATG4/ATG7/ATG3 等酶的作用下，被磷脂酰乙醇胺(PtdEth，PE)修飾后，轉(zhuǎn)換成LC3-Ⅱ。因此，LC3-Ⅱ是目前常用的自噬標(biāo)志物。此外，細(xì)胞內(nèi)p62含量的變化也能反映自噬水平抑制或誘導(dǎo)，因?yàn)閜62既是自噬受體，也可作為自噬底物被降解。

Fig 1 Synergistic inhibition effect on proliferation and apoptosis of HUVECs by HCQ combined with

A:The cell index of HUVECs after treated by HCQ,BEV,and HCQ combined with BEV; B:The cell apoptosis of HUVECs after treated by HCQ,BEV,and HCQ combined with BEV; C:The results of apoptosis assay by flow cytometry.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 Synergistic inhibition effect on formation of vascular structures in HUVECs by HCQ combined with BEV(scale bar=10 μm)

本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)內(nèi)源性LC3-Ⅱ變化以及輔助性檢測(cè)p62水平，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞自噬。研究結(jié)果顯示，羥氯喹(5 mg·L-1)組HUVEC細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯增加，p62蛋白水平表達(dá)也增加，提示羥氯喹抑制自噬潮后期，使LC3-Ⅱ降解受到抑制，并使p62的降解減少。然而，貝伐單抗(100 mg·L-1)不影響LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62蛋白的表達(dá)，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)合組與羥氯喹單藥組HUVEC細(xì)胞的LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62蛋白的表達(dá)也無明顯差異(Fig 3)。

Fig 3 Synergistic inhibition effect on proteins expression of p62 and LC3 in HUVECsafter treated by HCQ

**P<0.01vscontrol

mCherry-EGFP-LC3雙熒光標(biāo)記能通過顏色變化確定自噬潮水平高低。本實(shí)驗(yàn)中，羥氯喹能使HUVEC細(xì)胞中的LC3產(chǎn)生點(diǎn)狀聚集，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)合組與羥氯喹單藥組HUVEC細(xì)胞相比，無明顯變化(Fig 4)。

Fig 4 Effect of HCQ combined with BEV on autophagy in HUVECs using mCherry-EGFP-LC3 double fluorescence labeling(scale bar=1 μm)

2.5 電鏡觀察細(xì)胞自噬體及細(xì)胞線粒體自噬情況如Fig 5所示，電鏡細(xì)胞形態(tài)觀察(低倍)：正常HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞核大，形狀規(guī)則，細(xì)胞觸手生長正常。貝伐單抗組的HUVEC細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)一些空泡，細(xì)胞核出現(xiàn)核質(zhì)聚集現(xiàn)象；羥氯喹單獨(dú)處理組細(xì)胞核邊集，萎縮，染色質(zhì)聚集，胞質(zhì)變少，細(xì)胞觸手明顯變少，貝伐單抗和羥氯喹聯(lián)合處理組的HUVEC細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)了羥氯喹和貝伐單抗處理后出現(xiàn)的現(xiàn)象。

電鏡自噬體觀察(高倍)：正常HUVEC細(xì)胞可見少許自噬體，貝伐單抗處理組與對(duì)照組無明顯差異。羥氯喹處理組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的雙膜小泡，可見新月狀或者杯狀的雙膜或多層膜結(jié)構(gòu)，并且有包繞胞質(zhì)成分的趨勢(shì)，提示有線粒體自噬現(xiàn)象。聯(lián)合處理組與羥氯喹處理組自噬體表達(dá)情況相似。

電鏡線粒體觀察(高倍)：正常HUVEC細(xì)胞的線粒體數(shù)量、形態(tài)正常，貝伐單抗處理組的細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫脹。羥氯喹處理組的細(xì)胞線粒體外室明顯腫脹變性。貝伐單抗和羥氯喹聯(lián)合處理組的細(xì)胞線粒體損傷更加明顯，線粒體腫脹變性，有些線粒體周圍形成空泡狀結(jié)構(gòu)，或者被空泡包裹。

以上結(jié)果提示：羥氯喹抑制自噬，自噬體未能與溶酶體融合、降解，完成細(xì)胞自噬過程。此外，貝伐單抗和羥氯喹均可以損傷HUVEC細(xì)胞線粒體，聯(lián)合用藥可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡。

Fig 5 Effect of HCQ combined with BEV on autophagosomes and mitochondria of HUVECs(scale bar=1 μm)

2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用協(xié)同抑制HUVEC的可能機(jī)制按差異表達(dá)大于2倍的基因統(tǒng)計(jì)，如Fig 6A所示，與空白對(duì)照組相比，貝伐單抗組有1 801個(gè)基因下調(diào)，23個(gè)基因上調(diào)。羥氯喹組有3 774個(gè)基因下調(diào)，950個(gè)基因下調(diào)。為研究羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用協(xié)同抗腫瘤機(jī)制，我們比較了羥氯喹或貝伐單抗單藥組與聯(lián)合用藥組的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與貝伐單抗組相比，聯(lián)合用藥組有2 096個(gè)基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，945個(gè)基因表達(dá)發(fā)生下調(diào)。與羥氯喹組相比，聯(lián)合用藥組有80個(gè)基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，36個(gè)基因表達(dá)發(fā)生下調(diào)。這其中有69個(gè)共同的差異表達(dá)基因(Fig 6B、6C)。KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在磷酸肌醇代謝(inositol phosphate metabolism)、RNA運(yùn)輸(RNA transport)等代謝過程，以及與腫瘤相關(guān)的MAPK、ErbB、Ras、HIF-1、FoxO信號(hào)通路，此外，還富集在EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、鉑類耐藥、內(nèi)分泌耐藥(endocrine resistance)的過程(Fig 6D)。最后通過蛋白網(wǎng)絡(luò)圖分析，發(fā)現(xiàn)羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用可能主要通過調(diào)控RICTOR(雷帕霉素不敏感的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白伴侶，rapamycin insensitive companion of mammalian target of rapamycin)、PIK3CA等“hub”基因協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞(Fig 6E)。

3 討論

在腫瘤血管新生過程中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和其受體VEGFR結(jié)合產(chǎn)生的活化信號(hào)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。貝伐單抗是一種人源化的重組單克隆抗體，能夠特異性地靶向VEGF-A，阻止其結(jié)合VEGFR，從而抑制血管新生。目前，已被批準(zhǔn)用于治療結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)瘤。然而，無論是化療，還是靶向治療，都能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬，進(jìn)而幫助腫瘤細(xì)胞耐受抗腫瘤藥物引起的惡劣代謝環(huán)境，從而存活下來并形成抗藥性。有研究顯示，貝伐單抗能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬[13]。

羥氯喹不僅是溶酶體抑制劑，可以阻斷自噬過程，造成自噬小體和LC3Ⅱ出現(xiàn)明顯的的累積[7]，而且還具有抗腫瘤活性，也能夠促進(jìn)血管正常化、增加抗血管藥物的治療作用，只是羥氯喹的抗腫瘤機(jī)制非常復(fù)雜，尚未研究清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞也在血管新生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且HUVEC常被用于進(jìn)行腫瘤血管新生的實(shí)驗(yàn)。因此，本研究重點(diǎn)闡明羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用對(duì)HUVEC細(xì)胞生長的作用及機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，羥氯喹、貝伐單抗均對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖有抑制作用，對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，使血管狀結(jié)構(gòu)形成減少。與單藥組相比，羥氯喹和貝伐單抗聯(lián)合能夠協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞增殖，促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡，抑制HUVEC細(xì)胞血管狀結(jié)構(gòu)形成。此外，我們發(fā)現(xiàn)羥氯喹能夠增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和p62蛋白水平，表明羥氯喹使自噬潮后期受到抑制，導(dǎo)致LC3-Ⅱ降解受到抑制，及p62的降解減少。mCherry-EGFP-LC3雙熒光標(biāo)記和電鏡自噬體觀察也都證實(shí)羥氯喹可以抑制HUVEC細(xì)胞自噬。抑制細(xì)胞自噬可能是羥氯喹協(xié)同貝伐單抗抑制HUVEC細(xì)胞的機(jī)制之一。電鏡結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗和羥氯喹聯(lián)合處理組的HUVEC細(xì)胞線粒體損傷更加明顯，線粒體腫脹變性，有些線粒體周圍形成空泡狀結(jié)構(gòu)，或者被空泡包裹。為進(jìn)一步闡明貝伐單抗和羥氯喹聯(lián)合抑制HUVEC細(xì)胞的機(jī)制，我們還采用了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)羥氯喹比貝伐單抗引起的差異表達(dá)基因多，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用會(huì)產(chǎn)生69個(gè)共同的差異表達(dá)基因，主要富集在磷酸肌醇代謝、RNA運(yùn)輸、腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路(如MAPK、ErbB、Ras、HIF-1、FoxO信號(hào)通路等)，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、鉑類耐藥、內(nèi)分泌耐藥等過程。蛋白網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果表明，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用可能主要通過調(diào)控RICTOR、PIK3CA等“hub”基因，發(fā)揮協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞的作用。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細(xì)胞自噬均與PI3K/Akt/mTOR密切相關(guān)[14]。眾所周知，mTOR是一種PI3K相關(guān)激酶，能夠通過mTOR信號(hào)復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR信號(hào)復(fù)合物2(mTORC2)參與腫瘤細(xì)胞凋亡、周期以及細(xì)胞自噬等生物學(xué)過程。并且PIK3CA是PI3K的一個(gè)催化亞基，PIK3CA突變可促進(jìn)激酶活性，激活下游Akt，進(jìn)而增加細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。RICTOR是mTORC2的骨架蛋白，對(duì)其穩(wěn)定性至關(guān)重要，它參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的新陳代謝、增殖、凋亡、細(xì)胞自噬。例如，Lamanuzzi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RICTOR可能通過影響VEGF、CD31及MMP-9的合成和分泌，進(jìn)而調(diào)控腫瘤組織內(nèi)血管形成，影響體內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)，shRNA敲除RICTOR可以抑制自噬。

Fig 6 Transcriptome sequencing analysis of inhibitory mechanisms of HCQ combined with BEV in HUVECs

A:Quantitative analysis chart of differentially expressed genes among groups; B:Venn diagram of different expressed genes; C:Heatmap of different expressed genes among groups; D:KEGG analysis of different expressed genes; E:Protein network diagram analysis of the “hub” regulatory gene affected by HCQ combined with BEV.

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，羥氯喹和貝伐單抗聯(lián)用具有協(xié)同抑制HUVEC細(xì)胞增殖，促進(jìn)HUVEC細(xì)胞凋亡，抑制HUVEC細(xì)胞血管狀結(jié)構(gòu)形成等作用，提示羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用可能是一種可靠的抑制腫瘤血管的治療策略。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，羥氯喹與貝伐單抗聯(lián)用抑制腫瘤血管的機(jī)制不僅與羥氯喹抑制細(xì)胞自噬有關(guān)，而且還可能與RICTOR、PIK3CA等“hub”基因調(diào)控相關(guān)。