多種人結腸癌5-氟尿嘧啶耐藥細胞株的建立及耐藥機制初步研究

劉蒙，黃曉東，韓崢，朱慶曦，譚潔，劉維潔，陳巍，鄒艷麗，田霞

（武漢大學同仁醫(yī)院/武漢市第三醫(yī)院 消化內科，湖北 武漢 430061）

結腸癌是一種世界范圍內具有高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤[1-2]，且其發(fā)病率呈現(xiàn)迅速增長趨勢[3-4]。常見的治療方法有手術、放療和化療，對于非轉移性結腸癌，手術切除治療是最有效的治療方法。但對于轉移性結腸癌，手術后存在復發(fā)和轉移的風險，而術后輔助化療可以降低這些風險。5-氟尿嘧啶（5-FU）是結腸癌治療中最常用的輔助化療藥物之一，其可通過阻斷胸腺嘧啶的合成從而影響DNA的合成，并可誘導細胞周期阻滯和凋亡[5-6]。但5-FU對正常細胞具有毒性作用，而癌細胞也會對其產生耐藥性，這是結腸癌治療失敗的主要原因[7]。因此，研究細胞對5-FU產生耐藥性的機制，有助于提高結腸癌術后輔助化療的成功率，從而提高患者的生存率。建立耐藥細胞株對于腫瘤耐藥性機制的研究是十分必要的，本研究利用大劑量5-FU反復接觸結合藥物濃度遞增法誘導結腸癌細胞株HT-29、LoVo和SW480，從而建立結腸癌耐藥株HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU，并對原代細胞株和耐藥細胞株的生物學特性進行研究，初步探討結腸癌細胞對5-FU耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

兔抗P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）多克隆抗體、兔抗多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）多克隆抗體、兔抗ATP結合盒超家族G成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）單克隆抗體、兔抗第十號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）多克隆抗體、兔抗蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗體、兔抗p-Akt單克隆抗體購自英國Abcam；PVDF轉移膜、化學發(fā)光試劑購自美國Millipore；HRP標記的山羊抗兔IgG、PBS、PBST、MTT購自武漢Bioswamp；兔抗GAPDH單克隆抗體購自美國CST；AKT活性檢測試劑盒購自美國Abnova。

1.2 方法

1.2.1 建立耐藥細胞株采用高濃度5-FU反復接觸結合藥物濃度遞增法誘導結腸癌細胞建立耐藥細胞株。取生長狀況良好的HT-29、LoVo和SW480細胞，先用含10 μg/mL 5-FU的RPMI1640完全培養(yǎng)液在37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中誘導細胞。當細胞開始死亡時，用PBS清洗2次后置于不含5-FU的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞恢復生長后進行傳代處理，待細胞生長至對數(shù)期時再加入5-FU反復誘導。將藥物濃度每次增加10 μg/mL，歷時10個月獲得在含40 μg/mL 5-FU的RPMI1640完全培養(yǎng)液正常生長的HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU耐藥細胞株。撤藥兩周后，可用于各耐藥細胞株的生物學特性檢測實驗。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下，觀察結腸癌親本株HT-29、LoVo和SW480和耐藥株HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU的細胞形態(tài)。

1.2.3 MTT檢測藥物敏感性取對數(shù)生長期細胞并制成單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，待細胞融合貼壁后，分別加入藥物濃度為0、5、10、20、40、100 μg/mL 5-FU繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h，取出3個復孔，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)3 h后棄孔內液體，加入150 μL二甲基亞砜，使用酶標儀測定各藥物濃度處理組的OD490值。計算各時間段、各藥物濃度處理的細胞抑制率，分析細胞半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）和耐藥指數(shù)（resistant index，RI）。

1.2.4 流式檢測細胞周期取0、10、40 μg/mL 5-FU處理下對數(shù)生長的親本株和耐藥株，制備成單細胞懸液后收集1×106個細胞，棄上清，PBS清洗兩次后重懸細胞。-20 ℃預冷的70%乙醇固定細胞過夜。PBS清洗后，加入400 μL PI（50 μg/mL）和 10 μL RNase A（10 mg/mL）混勻后，37 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀根據(jù)細胞DNA含量不同對細胞計數(shù)，分析細胞周期情況。

1.2.5 qRT-PCR檢測mRNA表達水平取生長狀況良好的親本細胞和經過不同濃度5-FU（10、40 μg/mL）處理后的耐藥細胞，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，將其反轉錄為cDNA，然后進行PCR反應。反應條件：95 ℃變性5 s，56 ℃退火10s，72 ℃延伸30 s。引物序列見表1。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達水平取對數(shù)生長期細胞，加入裂解液，收集細胞總蛋白。以20 μL上樣量進行SDS-PAGE電泳，然后進行轉膜、封閉。根據(jù)說明書稀釋一抗（P-gp：1:5 000；MRP1：1:1 000；ABCG2：1:1 000；PTEN：1:1 000；AKT：1:2 000；p-Akt：1:1 000；GAPDH：1:1 000）和二抗（經HRP標記的山羊抗兔IgG：1:10 000），加入一抗室溫孵育1 h，PBST清洗2次后再加入二抗，室溫孵育1 h。PBST清洗后加入化學發(fā)光試劑，顯影，讀取條帶灰度值。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.7 Akt活性檢測根據(jù)Akt活性檢測試劑盒說明書操作，檢測各組結腸癌細胞的Akt活性水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

計量資料均以平均值±標準差（x±s）表示，利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，多組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

耐藥株細胞形態(tài)與親本株相比發(fā)生了較大的變化，親本細胞（HT-29、LoVo、SW480）一般為圓形或梭形，細胞體積較小，緊密貼壁生長。耐藥株（HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU）多為不規(guī)則形狀，且部分細胞具有偽足，細胞體積變大，細胞間隙較大，分布較松散，細胞內顆粒增加（圖1）。

圖1 親本細胞和耐藥細胞形態(tài)觀察（×200）Figure 1 Morphological observation of the parental cells and drug-resistant cells (×200)

2.2 藥物敏感性檢測

隨著5-F U藥物濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長，親本株細胞生長抑制率逐漸升高。耐藥株細胞生長抑制率也隨著5-F U濃度的升高而增長，但最終趨于穩(wěn)定，且隨著培養(yǎng)時間的延長，抑制率變化幅度不大。與親本株相比，耐藥株在各時間段、5-FU各濃度處理下的抑制率都低于親本株（圖2）。HT-29/5-FU細胞IC50為（1 051.000±22.76）μg/mL，HT-29細胞IC50為（145.713±12.39）μg/mL，RI=7.213；LoVo/5-FU細胞IC50為（689.995±17.77）μg/mL，LoVo細胞IC50為（117.969±10.14）μg/mL，RI=5.849；SW480/5-FU細胞IC50為（1 176.977±19.48）μg/mL，SW480細胞IC50為（73.84±6.33）μg/mL，RI=15.940。比較親本細胞和耐藥細胞的IC50，耐藥細胞的IC50明顯高于親本細胞（均P＜0.01）。

2.3 細胞周期分析

經過不同濃度的5-FU（0、10、40 μg/mL）處理后的親本細胞（HT-29、LoVo、SW480）和耐藥細胞（HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU）隨著5-FU濃度的升高，處于G0/G1期的細胞數(shù)量明顯增加（均P＜0.05），表明5-FU可以使結腸癌細胞阻滯在G0/G1期。與親本細胞相比較，同一濃度5-FU（不包含0 μg/mL）處理下的耐藥細胞處于G0/G1期的細胞數(shù)量明顯減少（均P＜0.05）（圖3）。

2.4 RT-PCR檢測耐藥相關基因的mRNA表達水平

與親本細胞HT-29、LoVo、SW480相比較，經過10、40 μg/mL的5-FU處理過的耐藥細胞的耐藥相關基因P-gp、MRP1、ABCG2、Akt的mRNA的表達水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），PTEN的mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）。與10 μg/mL 5-FU處理過的耐藥細胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU相比，40 μg/mL 5-FU處理過的耐藥細胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU的P-gp、MRP1、ABCG2、Akt mRNA的表達水平明顯升高（均P＜0.01），PTEN的mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）（圖4）。

圖2 MTT檢測細胞活力及細胞生長抑制曲線Figure 2 Cell viabilities measured by MTT and growth inhibition curves

圖3 5-FU處理后的親本細胞和耐藥細胞G0/G1期細胞比例 1）與未處理的親本細胞比較， P＜0.05；2）10 μg/mL 5-FU處理的親本細胞比較，P＜0.05；3）與40 μg/mL 5-FU處理的親本細胞比較，P＜0.05；4）與未處理的耐藥細胞比較，P＜0.05；5）與10 μg/mL 5-FU處理的耐藥細胞比較，P＜0.05Figure 3 Proportion of cells in G0/G1 phase in parental cells and drug-resistant cells after 5-FU treatment 1) P＜0.05 vs.untreated parental cells; 2) P＜0.05 vs.parental cells treated with 10 μg/mL 5-FU; 3) P＜0.05 vs.parental cells treated with 40 μg/mL 5-FU;4) P＜0.05 vs.untreated drug-resistant cells; 5) P＜0.05 vs.drug-resistant cells treated with 10 μg/mL 5-FU

2.5 Western blot 檢測耐藥相關基因的蛋白表達水平

經過10、40 μg/mL的5-FU處理過的耐藥細胞的P-gp、MRP1、ABCG2、p-Akt蛋白相對表達量明顯高于親本細胞（均P＜0.01），PTEN蛋白表達水平明顯低于親本細胞（均P＜0.01）。與10 μg/mL 5-FU處理過的耐藥細胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU比較，40 μg/mL 5-FU處理過的耐藥細胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU的P-gp、MRP1、ABCG2、p-AKT蛋白表達水平明顯升高（均P＜0.01），PTEN蛋白表達水平明顯降低（均P＜0.01）（圖5）。

圖4 RT-PCR檢測細胞P-gp、MRP1、ABCG2、AKT、PTEN的mRNA表達 1）與各自親本細胞比較，P＜0.01；2）與10 μg/mL 5-FU處理的同一耐藥株比較，P＜0.01Figure 4 The mRNA expression levels of P-gp, MRP1, ABCG2, Akt and PTEN detected by qRT-PCR 1) P＜0.01 vs.corresponding parent cells; 2) P＜0.01 vs.same drug-resistant cell line treated with 10 μg/mL 5-FU

圖5 Western blot檢測細胞P-gp、MRP1、ABCG2、p-Akt、PTEN蛋白表達 1）與各自親本細胞比較，P＜0.01；2）與10 μg/mL 5-FU處理的同一耐藥株比較，P＜0.01Figure 5 The protein expressions of P-gp, MRP1, ABCG2, p-Akt and PTEN detected by Western blot 1) P＜0.01 vs.corresponding parent cells; 2) P＜0.01 vs.same drug-resistant cell line treated with 10 μg/mL 5-FU

2.6 Akt活性水平比較

利用A k t活性檢測試劑盒檢測A k t活性，p-GSK-3α蛋白表達量的高低反映了細胞中Akt的活性水平，結果顯示，與HT-29、LoVo、SW480相比，10、40 μg/mL 5-FU處理后的HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU的p-GSK-3α蛋白相對表達量均明顯升高，且呈明顯濃度依賴性（均P＜0.05）（圖6）。

圖6 Akt活性檢測 1）與各自親本細胞比較，P＜0.01；2）與10 μg/mL 5-FU處理的同一耐藥株比較，P＜0.01Figure 6 Detection of Akt activities 1) P＜0.01 vs.corresponding parent cells; 2) P＜0.01 vs.same drug-resistant cell line treated with 10 μg/mL 5-FU

3 討 論

對于不能進行手術切除的轉移性結腸癌患者，若無其他方法治療，其平均預期壽命約為8個月，治療轉移性結腸癌的標準藥物有5-FU、奧沙利鉑和伊立替康等[8]。5-FU單獨使用或與其他藥物聯(lián)合治療可作為結腸癌術后輔助化療形式[9]，5-FU是一種胸腺嘧啶合成酶（thymidylate synthetase，TS）的抑制劑，從而有抑制DNA合成的作用。而且，5-FU對RNA的合成也有一定的抑制作用[10]。由于5-FU是結腸癌術后輔助化療的一種重要藥物，所以研究其耐藥機制對于結腸癌的治療是十分必要的。建立5-FU耐藥細胞模型是研究耐藥機制十分必要的一步，邱婷婷等[11]通過低濃度5-FU劑量遞增法建立了結腸癌耐藥細胞株HT-29/5-FU，耐藥細胞較親本細胞生長緩慢，S期細胞增多，G0/G1期細胞減少。而本次研究通過高濃度5-FU反復接觸并結合藥物濃度遞增的方法建立了3種結腸癌細胞（HT-29、LoVo、SW480）的耐藥株，檢測發(fā)現(xiàn)耐藥株的耐藥性顯著高于親本株，且減緩了5-FU對細胞產生的G0/G1期阻滯作用。

5-FU化療耐藥機制包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥，原發(fā)性耐藥與胸苷酸合成酶表達水平升高密切相關[12]，而獲得性耐藥機制并不十分明確。有學者[13]認為其可能的耐藥機制是通過激活或過表達藥物流失通路的相關蛋白，從而降低細胞內藥物濃度，抑制治療效果。而這些蛋白包括多藥耐藥蛋白（MDR1、P-gp、ABCB1）、多藥耐藥相關蛋白1（MRP1、ABCC1）、ABCG2，表達上調會抑制藥物對癌細胞的毒性作用，增強細胞對藥物的存活能力[13-15]。臨床檢測發(fā)現(xiàn)多藥耐藥蛋白在大腸癌組織中高表達，可能參與了大腸癌多藥耐藥的形成過程[16]。本研究結果顯示：P-gp、MRP1和ABCG2在耐藥株中的表達水平顯著高于親本株，而這些耐藥蛋白的高表達導致耐藥細胞的耐藥性高于親本細胞，而且高濃度的5-FU對耐藥細胞的處理促進了耐藥相關蛋白的表達。

PTEN是一種重要的抑癌基因，大量研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤疾病中，常常出現(xiàn)PTEN的突變和缺失[17-19]。PTEN的蛋白產物是一種特異性磷酸酶，在Akt信號通路中發(fā)揮著重要的作用，通過下調PI3K/Akt信號通路抑制腫瘤細胞的生長[20-21]。PI3K/AKT信號通路可減少細胞凋亡，促進細胞生長和增殖，通過靶向調控PTEN表達水平，降低PI3K/Akt通路激活，可抑制結腸癌細胞增殖，誘導凋亡[22-23]。抑制PI3K/Akt信號通路可以增加結腸癌細胞對5-FU的敏感性，PI3K的協(xié)同作用可促進Akt磷酸化，而p-Akt可作為5-FU療效的標志物[24]。研究[25]顯示，下調PTEN，增加p-Akt水平可誘導藥物敏感結腸癌細胞產生耐藥特性。在本研究中，結腸癌耐藥細胞中PTEN蛋白低表達降低了對PI3K/Akt信號通路的抑制作用，而PI3K/Akt的激活導致細胞對5-FU的耐藥性增強。

綜上所述，本次研究通過大劑量5-FU反復接觸結合藥物濃度遞增的方法成功建立了耐5-FU的結腸癌細胞株H-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU。并對親本細胞和耐藥細胞的生物學特性進行研究，推測PTEN/PI3K/Akt信號通路可能參與了結腸癌細胞對5-FU的耐藥機制。耐藥株的建立及耐藥機制的研究將對今后結腸癌的臨床治療和耐藥研究提供重要的理論基礎。