多梳蛋白4與含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白4A在胃癌組織中的表達(dá)及與意義

錢海權(quán)，周海寧，劉軻，趙偉

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 胃腸外科，寧夏 銀川 750004）

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的全球性常見惡性腫瘤，我國是胃癌高發(fā)國家，2015年新發(fā)病例約67.9萬，死亡病例約49.8萬[1]，發(fā)病率和病死率均占全球胃癌發(fā)病率和病死率的50%[2]。隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改善，我國胃癌發(fā)病率和病死率呈下降趨勢，但仍處于世界較高水平，依然嚴(yán)重威脅人類健康[3]。隨著科技和醫(yī)療水平的發(fā)展，對胃癌研究取得很大進(jìn)展，但其早期篩查不易，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)80%以上均已進(jìn)入中晚期。另外，胃癌患者術(shù)后5年生存率較低，僅為30%左右[4-6]。胃癌發(fā)生發(fā)展過程極其復(fù)雜，與患者生活飲食習(xí)慣、工作壓力增大、遺傳因素及幽門螺旋桿菌感染等因素密切相關(guān)，此外，抑癌基因突變、失活、原癌基因激活等均可使細(xì)胞惡性增殖，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[7-11]。因此研究與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物具有重要意義。chromobox（CBX）家族屬于多梳基因家族蛋白（polycomb group protein，PcG）家族中特殊的一類，CBX包括5個亞型，多梳蛋白4（chromobox homolog 4，Cbx4）是一種泛素化（SUMO）E3連接酶，可抑制上皮干細(xì)胞的激活和分化，促進(jìn)腫瘤血管生成[12-14]。含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白4A（FERM domain-containing protein 4A，F(xiàn)RMD4A）可促進(jìn)癌細(xì)胞生長，其高表達(dá)與頭頸部鱗癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險高度相關(guān)[15-16]。但Cbx4和FRMD4A蛋白在胃癌中的研究尚鮮有報道，因此本研究擬觀察Cbx4和FRMD4A蛋白在胃癌組織中表達(dá)，研究其與胃癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010年2月—2013年11月在本院初診胃癌患者112例作為研究對象，其中男60例，女52例；年齡35～70歲，平均年齡（51.25±11.65）歲，收集患者臨床資料及手術(shù)過程中胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本。本研究經(jīng)過院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 經(jīng)手術(shù)病理確診為胃癌患者；⑵ 自愿參加治療調(diào)查者；⑶ 術(shù)前未接受放化療；⑷ 有完整隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 患有其他惡性腫瘤者；⑵ 患有嚴(yán)重肝腎等重要臟器疾病者；⑶ 患有自身免疫性疾病者；⑷ 生活不能自理或精神狀態(tài)異常者；⑸隨訪資料不完整者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑及儀器TRIzol試劑（編號：R0016）購自上海碧云天； PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（編號：RR037A）、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（編號：6210A）購自北京TaKaRa； 鼠 源 anti-Cbx4（ 貨 號：MA5-31666）適用稀釋濃度1:500，兔源anti-FRMD4A（貨號：PA5-58394）適用稀釋濃度1:100，均購自美國Invitrogen；紫外分光光度計（美國Thermo公司）、qRT-PCR儀7500（美國Bio-Rad公司）等。

1.3.2 標(biāo)本采集收集112例胃癌患者手術(shù)中胃癌組織標(biāo)本，及距離癌旁組織＞5 cm處癌旁組織標(biāo)本，一部分于液氮中保存?zhèn)溆?，另一部分制備石蠟?biāo)本。

1.3.3 臨床病例特征分期標(biāo)準(zhǔn)胃癌采用2018年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會（International Union Against Cancer/ American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[17]：T（原發(fā)灶），T1+T2（孤立腫瘤無血管受侵+孤立腫瘤有血管受侵或多發(fā)腫瘤直徑≤5 cm）21例，T3+T4（多發(fā)腫瘤直徑＞5 cm+侵及周圍組織）91例；N（區(qū)淋巴結(jié)），N0（無淋巴轉(zhuǎn)移）39例，N1（區(qū)域淋巴轉(zhuǎn)移）73例；M（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移），無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移69例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移43例；分化程度，低分化41例，中分化31例，高分化40例。

1.3.4 qRT-PCR檢測Cbx4和FRMD4AmRNA表達(dá) 采用TRIzol提取胃癌及癌旁組織總RNA，紫外分光光度計檢檢測總 RNA 濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用qRTPCR檢測胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A mRNA相對表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)采用20 μL體系：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，ROX Reference Dye or Dye II（50×）0.4 μL ，cDNA（50 ng/μL）2 μL， 上 下 游 引 物（10 μmol/L）各 0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)采用兩步法，條件設(shè)置為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個循環(huán)；添加溶解曲線。Cbx4、FRMD4A及內(nèi)參β-actin的引物（由上海生工合成）序列見表1。采用2-ΔΔCT法對胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A mRNA相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.5 免疫組化法檢測Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)石蠟組織切塊以4 μm厚度連續(xù)切片，之后置于60 ℃烤箱1 h，取出后置于預(yù)熱二甲苯溶液中浸泡10 min，重復(fù)3次；梯度乙醇浸泡脫水，3%雙氧水室溫避光滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，枸櫞酸鈉抗原高壓修復(fù)5 min，添加Cbx4（1:500）和FRMD4A（1:100）蛋白多克隆抗體，4℃孵育過夜，依次添加生物素標(biāo)記二抗和DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.6 陽性結(jié)果判定由2名資深病理醫(yī)師雙盲法分別對染色結(jié)果進(jìn)行半定量評分。細(xì)胞漿或核內(nèi)呈黃色或棕色顆粒為陽性染色，采用免疫反應(yīng)積分（IRS）法進(jìn)行評分：染色強(qiáng)度（SI）積分，無著色（0分），淡黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）；陽性染色細(xì)胞百分比（PP）積分，陰性（0分），PP 1%～10%（1分），PP 11%～50%（2分），PP 51%～75%（3分），PP 76%～100%（4分）。IRS= SI×PP，IRS＞3為陽性。

1.4 隨訪

對所有治療出院后的胃癌患者進(jìn)行電話或門診隨訪，隨訪時間為1～60個月，末次隨訪時間截止2018年12月30日，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止日期，觀察記錄患者隨訪期間胃癌生存死亡情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，進(jìn)行χ2檢驗，計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗，多組資料進(jìn)行單因素方差分析；采用Cox多因素回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的因素。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A mRNA表達(dá)水平比較

與癌旁正常組織比較，胃癌組織中Cbx4和FRMD4A mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）（表2）。

2.2 胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平比較

Cbx4和FRMD4A陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀（圖1）。Cbx4在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織（χ2=21.987，P=0.012），F(xiàn)RMD4A在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.459，P=0.005）（表3）。

表2 胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A mRNA表達(dá)水平比較（n=112，±s）Table 2 Comparison of the mRNA levels of Cbx4 and FRMD4A in gastric carcinoma and adjacent tissue (n=112,±s)

表2 胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A mRNA表達(dá)水平比較（n=112，±s）Table 2 Comparison of the mRNA levels of Cbx4 and FRMD4A in gastric carcinoma and adjacent tissue (n=112,±s)

組別 Cbx4 FRMD4A胃癌組織 2.38±0.25 3.27±0.64癌旁組織 1.14±0.32 1.29±0.35 t 47.332 28.726 P ＜0.001 ＜0.001

圖1 免疫組化檢測Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)（×400）Figure 1 Immunohistochemical staining for protein expressions of Cbx4 and FRMD4A（×400）

表3 胃癌及癌旁組織中Cbx4和FRMD4A蛋白陽性表達(dá)率比較[n=112，n（%）]Table 3 Comparison of the positive expression rates of Cbx4和 FRMD4A proteins in gastric cancer and surrounding tissue [n=112, n (%)]

2.3 Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

112例胃癌組織中，Cbx4陽性表達(dá)組78例，陰性表達(dá)組34例；FRMD4A陽性表達(dá)組81例， 陰性表達(dá)組31例。分析結(jié)果顯示，Cbx4及FRMD4A表達(dá)水平與胃癌患者年齡、性別無關(guān)（P＞0.05），與T分期（χ2=14.073、13.094，P均=0.000）、N分期（χ2=1 3.9 5 7、2 2.5 2 3，P=0.0 0 1、0.000）、分化程度（χ2=14.176、20.632，均P=0.000）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（χ2=5.503、10.331，P=0.019、0.001）有關(guān)（P＜0.05）（表4）。

表4 Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n=112，n（%）]Table 4 Relations of Cbx4 and FRMD4A expressions with clinicopathologic features of gastric cancer patients [n=112, n (%)]

2.4 胃癌組織中Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平與胃癌患者5年生存率的關(guān)系

112例胃癌患者5年內(nèi)死亡72例，存活40例，5年總生存率為3 5.7 1%。生存分析結(jié)果顯示，C b x 4蛋白陽性表達(dá)胃癌患者5年生存率（13.89%）明顯低于陰性表達(dá)患者（46.05%）（χ2=15.42，P=0.000）；FRMD4A蛋白陽性表達(dá)胃癌患者5年生存率（11.77%）明顯低于陰性表達(dá)患者（46.15%）（χ2=21.55，P=0.000）（圖2）。

圖2 Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)與胃癌患者5年生存率的關(guān)系Figure 2 Relations of the Cbx4 and FRMD4A protein expressions withthe 5-year survival rates of the gastric cancer patients

2.5 Cox回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的危險因素

單因素分析顯示，胃癌患者T分期、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、胃癌組織中Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平是影響胃癌患者預(yù)后的危險因素。Cox多因素分析顯示，T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素（均P ＜0.05）（表5）。

表5 胃癌患者預(yù)后因素的Cox回歸分析Table 5 Cox regression analysis of prognostic factors for gastric cancer patients

3 討 論

P c G蛋白在胚胎早期和腫瘤形成過程中出現(xiàn)，主要存以多梳蛋白復(fù)合體（polycomb group complex，PRC）蛋白形式存在，主要包括Cbx2、Cbx4、Cbx6、Cbx7、Cbx8等成員，該類蛋白是一種在染色質(zhì)水平上通過表觀遺傳修飾抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，在DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、衰老中起重要作用，與細(xì)胞增殖、分化、腫瘤形成密切相關(guān)[18-21]。Ni等[22]研究報道，Cbx7與p-Akt、胃癌組織干細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4、CD133呈正相關(guān)，可通過下調(diào)p16、激活A(yù)kt-NF-кB-miR-21信號通路維持胃癌干細(xì)胞樣特性。Cbx4是PcG蛋白家族中一種特殊蛋白，它是一種SUMO E3連接酶，Mei等[23]研究報道，Cbx4可通過對低氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）第391位及477位賴氨酸殘基SUMO化修飾上調(diào)其活性，進(jìn)而調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌血管再生。Zheng等[24]研究報道，Cbx4表達(dá)水平升高可促進(jìn)肝癌腫瘤生長，過表達(dá)miR-195可靶向下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞中Cbx4表達(dá)水平，抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Cbx4 mRNA及蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，且Cbx4陽性表達(dá)與胃癌T、N分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Cbx4在其他腫瘤中報道一致[24-25]，提示Cbx4陽性表達(dá)可能與胃癌發(fā)生發(fā)展及嚴(yán)重程度有關(guān)，但是否與其他癌癥中類似機(jī)制，有待進(jìn)一步探究。

FRMD4A是一類具有FERM結(jié)構(gòu)域蛋白，可連接細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞骨架、協(xié)助維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜穩(wěn)定，可促進(jìn)癌細(xì)胞生長，在頭頸癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26-28]。鄭相淮等[29]研究報道，F(xiàn)RMD4A高表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，下調(diào)FRMD4A蛋白表達(dá)，可將舌癌CAL-27細(xì)胞阻滯在G1期，抑制其增殖。Zheng等[15]研究顯示，F(xiàn)RMD4A蛋白表達(dá)與舌癌發(fā)生有關(guān)，沉默F(xiàn)RMD4A基因可以降低CAL27細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，并顯著抑制CAL27細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織比較，胃癌組織中FRMD4A mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，且與胃癌T、N分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FRMD4A蛋白表達(dá)可能對胃癌發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，有潛力成為胃癌病情監(jiān)測敏感指標(biāo)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Cbx4和FRMD4A蛋白陽性表達(dá)組胃癌患者5年生存率均明顯低于陰性表達(dá)組患者，且T分期、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素，提示檢測Cbx4和FRMD4A蛋白表達(dá)水平可能對胃癌患者預(yù)后評估有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，Cbx4和FRMD4A蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌臨床分期、分化程度及5年生存率有關(guān)，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，可能對胃癌臨床靶向治療及預(yù)后評估提供一定理論基礎(chǔ)。但由于本研究樣本量較少，結(jié)果具有局限性，另關(guān)于Cbx4和FRMD4A對胃癌細(xì)胞生物活性的影響及具體作用機(jī)制及有待進(jìn)一步探索。