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    麻黃堿對腦缺血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)的影響及分子機(jī)制研究

    2019-11-05 09:37:17李倩
    湖北畜牧獸醫(yī) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:分子機(jī)制運(yùn)動功能麻黃堿

    李倩

    摘要:為研究麻黃堿對腦缺血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)的影響及相關(guān)的分子機(jī)制,選取體重為220~250 g的56只雄性SD大鼠,并隨機(jī)將其分為麻黃堿治療組、自然恢復(fù)組和假手術(shù)組,應(yīng)用Koizumi線栓法建立單側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。應(yīng)用橫木行走試驗(yàn)在術(shù)后1、2、3、4周對其運(yùn)動功能改善情況進(jìn)行評定,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對缺血周圍區(qū)突觸素(SYP)、生長相關(guān)蛋白(GAP-43)表達(dá)的變化進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,在各時間點(diǎn),假手術(shù)組大鼠運(yùn)動功能無明顯改變(P>0.05);在術(shù)后1周,運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組,但隨著時間的推移,自然恢復(fù)組的運(yùn)動功能不斷改善;相對于自然恢復(fù)組而言,麻黃堿治療組運(yùn)動功能恢復(fù)速度明顯更快,且在術(shù)后1、2、3周,麻黃堿治療組均明顯快于自然恢復(fù)組(P<0.05);4周之后,3組之間無顯著差異(P>0.05)。在1、2、3周時,免疫組化光密度定量測定結(jié)果顯示麻黃堿治療組GAP-43和SYP的表達(dá)水平均明顯高于自然恢復(fù)組。說明麻黃堿可對腦缺血后動物的運(yùn)動功能恢復(fù)速度進(jìn)行加速,且麻黃堿的加速機(jī)制與促進(jìn)腦內(nèi)結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)重塑的分子表達(dá)有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:麻黃堿;腦缺血;大鼠;運(yùn)動功能;分子機(jī)制

    中圖分類號:R49? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A? ? ? ? 文章編號:1007-273X(2019)09-0005-02

    麻黃一直被中醫(yī)認(rèn)為有著活血通絡(luò)的功效。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示,在對腦缺血所致的中風(fēng)后遺癥進(jìn)行治療時,麻黃與其他中藥配伍使用,對神經(jīng)功能缺損癥狀有明顯的改善。然而,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)的作用及機(jī)理方面,單味的麻黃卻沒有明確的定論,但相關(guān)人士普遍認(rèn)為與麻黃的主要藥用成分麻黃堿有關(guān)?;诖?,本次研究選取了56只雄性SD大鼠,應(yīng)用Koizumi線栓法建立單側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)模型,以此來研究麻黃堿對腦缺血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。

    1? 材料與方法

    1.1? 分組動物

    選取體重為220~250 g的56只雄性SD大鼠,隨機(jī)將其分為麻黃堿治療組(24只)、自然恢復(fù)組(24只)和假手術(shù)組(8只)。術(shù)后1、2、3、4周為各組的4個時間點(diǎn),且在各時間點(diǎn)取不同數(shù)量的大鼠(麻黃堿治療組6只,自然恢復(fù)組6只和假手術(shù)組2只)進(jìn)行各項(xiàng)目的檢測。

    1.2? 模型的制備

    應(yīng)用Koizumi線栓法建立單側(cè)MCAO模型。首先麻醉大鼠,固定于手術(shù)臺上時取仰臥位,頸前正中行縱行切口,對頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)、右側(cè)頸總動脈(CCA)進(jìn)行分離暴露,并結(jié)扎CCA近端和ECA根部,剝離迷走神經(jīng)。由頸外動脈插入栓線,經(jīng)頸內(nèi)動脈到大腦前動脈,機(jī)械性阻斷大腦中動脈發(fā)出處的血供來建立大腦中動脈缺血模型。如果需要再灌注,只需拔出栓線結(jié)扎傷口,即可恢復(fù)大腦血供。本試驗(yàn)缺血2 h后取出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組步驟與手術(shù)組相同,只是不插入栓線。

    1.3? 給藥方法

    大鼠手術(shù)后,麻黃堿治療組大鼠使用麻黃堿腹腔注射(3 mg/kg體重),每3 d注射一次,其余兩組給予同劑量的生理鹽水進(jìn)行注射。

    1.4? 對運(yùn)動功能進(jìn)行評定

    應(yīng)用橫木行走試驗(yàn)在術(shù)后1、2、3、4周對大鼠運(yùn)動功能改善情況進(jìn)行評定。橫木放置于距地面70 mm的高度,直徑25 mm,長1 200 mm。按照0~6分法來劃分等級。6分:無腳滑現(xiàn)象,能到達(dá)終點(diǎn);5分:少量腳滑現(xiàn)象,能到達(dá)終點(diǎn);4分:在一半以上的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象,能到達(dá)終點(diǎn);3分:肢體在前進(jìn)時不起作用,能到達(dá)終點(diǎn);2分:在前進(jìn)時掉下;1分:可以站在橫木上,不能前進(jìn);0分:掉下。

    1.5? 免疫組織化學(xué)檢測

    應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對缺血周圍區(qū)突觸素(SYP)、生長相關(guān)蛋白(GAP-43)表達(dá)的變化進(jìn)行檢測。SYP及GAP-43均為Sigma公司產(chǎn)品。整個操作過程均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

    1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和圖像分析

    用積分光密度值反映SYP和GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的強(qiáng)度和面積。要得出積分光密度值,首先要求出各陽性區(qū)光密度的積分和(∑∫ OD)。被檢各區(qū)在每例標(biāo)本中均對3張切片進(jìn)行檢測,并取其均值。用x±s表示所得結(jié)果。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 各試驗(yàn)組在不同時間的運(yùn)動功能評分

    由表1可見,假手術(shù)組大鼠運(yùn)動功能在各時間點(diǎn)均無明顯改變(P>0.05);在術(shù)后1周,運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組,但隨著時間的推移,自然恢復(fù)組大鼠的運(yùn)動功能不斷改善;相對于自然恢復(fù)組,麻黃堿治療組大鼠恢復(fù)速度明顯更快,且在術(shù)后1、2、3周均明顯快于自然恢復(fù)組(P<0.05);4周之后,3組之間無顯著差異(P>0.05)。

    2.2? GAP-43免疫組化染色結(jié)果

    神經(jīng)氈位置為GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的主要存在區(qū),其染色也隨著免疫產(chǎn)物和免疫反應(yīng)的增強(qiáng)而加深。

    假手術(shù)組:少量著色位于神經(jīng)氈位置,免疫產(chǎn)物在兩半球?qū)ΨQ分布。不同的時間點(diǎn)之間無顯著差異(P>0.05)。

    自然恢復(fù)組:在梗死中心區(qū)未見到GAP-43的表達(dá)。在1周時GAP-43在梗死周圍區(qū)的免疫活性達(dá)到高峰,在2周時開始降低,4周之后與假手術(shù)組之間無明顯差異(P>0.05)。

    麻黃堿治療組:與自然恢復(fù)組有相同的GAP-43表達(dá)變化趨勢。相較于自然恢復(fù)組,在前3個時間點(diǎn)其表達(dá)水平均明顯偏高(P<0.05)(表2)。

    顆粒狀沉積或棕黃色點(diǎn)狀為SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物,神經(jīng)氈內(nèi)為SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的分布位置。免疫反應(yīng)強(qiáng)弱與突觸類型、顆粒的大小有關(guān)。

    假手術(shù)組:神經(jīng)氈內(nèi)免疫產(chǎn)物在兩半球?qū)ΨQ分布。不同的時間點(diǎn)之間無明顯差異(P>0.05)。

    自然恢復(fù)組:未在梗死中心區(qū)見到SYP表達(dá)。在1周時SYP在梗死周圍區(qū)的免疫活性開始增高,在2周時達(dá)到高峰,在3周時則開始降低,4周之后,3組之間無顯著差異(P>0.05)。

    麻黃堿治療組:與自然恢復(fù)組具有相同的SYP表達(dá)變化趨勢,相較于自然恢復(fù)組,其在前3個時間點(diǎn)的表達(dá)水平均明顯偏高(P<0.05)(表2)。

    3? 討論

    麻黃具有利尿消腫、宣肺平喘、發(fā)汗散寒等功能,入肺、膀胱,性味辛苦溫,是我國寶貴的藥用植物。在對神經(jīng)可塑性的影響方面,麻黃對神經(jīng)可塑性的正性影響通過本研究得到證實(shí)。動物整體恢復(fù)狀況可以通過對側(cè)前肢感覺運(yùn)動整合功能的改善情況反映出來[1]。對動物感覺運(yùn)動整合功能恢復(fù)情況進(jìn)行評價(jià)的方法就是橫木行走試驗(yàn)。本次研究結(jié)果顯示,在各時間點(diǎn),假手術(shù)組運(yùn)動功能無明顯改變(P>0.05);在術(shù)后1周,運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組,但隨著時間的推移,自然恢復(fù)組的運(yùn)動功能不斷改善;相較于自然恢復(fù)組,麻黃堿治療組運(yùn)動功能恢復(fù)速度明顯更快,且在術(shù)后1、2、3周均明顯快于自然恢復(fù)組(P<0.05);3組的運(yùn)動功能在術(shù)后4周時均無明顯差異(P>0.05)。這說明麻黃堿有促進(jìn)神經(jīng)康復(fù)的作用。

    軸突生長錐質(zhì)膜面是GAP-43表達(dá)產(chǎn)物的主要位置,且GAP-43作為一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸蛋白,與突觸重建、軸突再生以及神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān),該產(chǎn)物于20世紀(jì)80年代初被發(fā)現(xiàn)[2]。GAP-43在腦皮層中的表達(dá)水平在成年時較低,在損傷時則顯著增強(qiáng),突觸重建、軸突芽生的狀態(tài)也與其表達(dá)強(qiáng)度相一致。因此GAP-43的表達(dá)可以作為常用的腦缺血損傷后的神經(jīng)生長及再生的量化指標(biāo)。本次研究結(jié)果顯示,GAP-43表達(dá)在腦梗死后明顯增加,在缺血再灌注后1周時GAP-43在梗死周圍區(qū)的免疫活性達(dá)到高峰,在2周時開始降低。麻黃堿治療組與自然恢復(fù)組具有相同的GAP-43表達(dá)變化趨勢,且麻黃堿治療組的GAP-43表達(dá)水平在前3個時間點(diǎn)均明顯高于自然恢復(fù)組(P<0.05)。

    SYP是一種位于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合蛋白,其新生突觸的形成可由突觸數(shù)量的增加來提示。其主要作用在鈣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中,是蛋白酪氨酸激酶的底物[3]。本次研究中,SYP在梗死周圍區(qū)的免疫活性在1周時開始增高,2周時達(dá)到高峰,3周時開始降低。麻黃堿治療組與自然恢復(fù)組有相同的SYP表達(dá)變化趨勢,且麻黃堿治療組SYP表達(dá)水平在前3個時間點(diǎn)均明顯高于自然恢復(fù)組(P<0.05)。

    4? 小結(jié)

    本次研究結(jié)果顯示,SYP和GAP-43的表達(dá)強(qiáng)度在麻黃堿治療組中明顯增強(qiáng),說明對于腦結(jié)構(gòu)再塑而言,麻黃堿有著積極作用。麻黃堿可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)如5-羥色胺、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

    本次研究結(jié)果顯示,在各時間點(diǎn),假手術(shù)組大鼠運(yùn)動功能無明顯改變(P>0.05);在術(shù)后1周,運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組,但隨著時間的推移,自然恢復(fù)組的運(yùn)動功能不斷改善;相較于自然恢復(fù)組,麻黃堿治療組運(yùn)動功能恢復(fù)速度明顯更快,且在術(shù)后1、2、3周均明顯快于自然恢復(fù)組(P<0.05);3組的運(yùn)動功能在術(shù)后4周時均無明顯差異(P>0.05)。在1、2、3周時,免疫組化光密度定量測定結(jié)果顯示麻黃堿治療組GAP-43和SYP的表達(dá)水平均明顯高于自然恢復(fù)組。上述結(jié)論表明,麻黃堿可對腦缺血后動物的運(yùn)動功能恢復(fù)速度進(jìn)行加速,且麻黃堿的加速機(jī)制與促進(jìn)腦內(nèi)結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)重塑的分子表達(dá)有關(guān)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 王海英,亞白柳,王文淼,等.電針對腦缺血-再灌注損傷大鼠運(yùn)動功能的改善作用及機(jī)制研究[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2018,41(5):313-316,321.

    [2] 胡? 艷,張香玉,魯銀山,等.成對關(guān)聯(lián)刺激對腦缺血再灌注大鼠感覺運(yùn)動功能和MAP-2、GAP-43表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2018,40(10):733-739.

    [3] 鄢云彪,華? 駿,蘭新新,等.銀杏內(nèi)酯注射液對腦缺血再灌注大鼠運(yùn)動認(rèn)知功能的影響[J].中藥藥理與臨床,2018,34(1):66-69.

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