產氣莢膜梭菌VirS/VirR雙組分系統調控機制研究進展

王艷華，KHAN MUZ，許 笑，蔡建平

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種革蘭氏陽性厭氧芽胞桿菌，廣泛存在于自然界，尤其是在土壤、人類和動物的腸道中廣泛存在。它可以感染人和各種動物(主要為牛、羊等)，造成人類食物中毒，引起動物壞死性腸炎、腸毒血癥以及創(chuàng)傷性氣性壞疽等疾病。這些病不僅嚴重威脅著人類和動物的健康，而且給社會造成了巨大的經濟損失[1-3]。最近，依據產氣莢膜梭菌產生的主要毒素和致病性的不同，將其修訂為7個型(A至G型，見表1)[4]。在所有類型的產氣莢膜梭菌中α-毒素(CPA)都是最保守的，其基因位于染色體上，編碼β-、ε-、ι-、CPE和NetB毒素的基因位于質粒上[5]，A型菌株被認為是人類最易感染的病原體[6]。

表1 產氣莢膜梭菌毒素型
Tab.1C.perfringenstoxin-based typing scheme

Toxinotype(toxin gene)a-toxin (plc or cpa) β-toxin(cpb) ε-toxin(etx)i-toxin(iap and ibp)CPE(cpe)NetB(netB)A+-----B+++---C++--+/--D+-+-+/--E+--++/--F+---+/--G+----+

注：+為indicates production of that toxin；- 為indicates no production of that toxin.

20世紀80年代以來，人們對產氣莢膜梭菌的多種酶、毒素基因及其產物的功能以及它們與宿主的相互作用進行了深入研究。這些毒素和酶具有特定的活性，通常毒素和酶協同作用，從而使其在致宿主組織病變過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。20世紀70年代，有人提出產氣莢膜梭菌中存在調節(jié)毒素產生的特定機制[7,10]。之后，研究人員報道了一種小信號分子參與穿孔溶血素O產生的調節(jié)[11-12]。1994年產氣莢膜梭菌雙組分VirS/VirR調節(jié)系統得以鑒定，并認為毒素的產生受該系統嚴格調控[13-14]，例如，A型產氣莢膜梭菌僅在芽胞形成過程中產生腸毒素(CPE)。此后，發(fā)現許多毒素基因受VirS/VirR雙組分調控系統和輔助基因調節(jié)因子(agr)群體感應(QS)系統的調控。進一步研究發(fā)現幾種雙組分系統和RNA調節(jié)因子形成一個緊密的網絡對毒素的產生進行調控[9]。因此，產氣莢膜梭菌毒素產生和調控機制研究成為人們了解和闡明該病原菌致病性的一個最重要的方面。產氣莢膜梭菌的幾個雙組分調控系統已經被廣泛分析，本文主要就VirS/VirR系統對產氣莢膜梭菌毒素的調控機制進行綜述，以期能為今后該菌致病機理研究和抗菌藥物的開發(fā)奠定新的起點。

1 雙組分調控系統組成

雙組分系統是細菌最關鍵的信號轉導系統，可以感知環(huán)境并將信息傳輸至細胞中[15]。一個典型的雙組分系統通常由位于膜的傳感器組氨酸激酶和充當轉錄調節(jié)因子的細胞質反應調節(jié)子組成[16]。組氨酸激酶是細菌感應各種環(huán)境變化必需的，通常是由2個單體組成的同源二聚體膜蛋白，每個單體含有1個可變的傳感器結構域(sensor domain) 和1個保守的傳遞器結構域(transmitter domain)，2個跨膜結構域通過1個α-螺旋相連。其傳感器結構域能感應環(huán)境變化，并將信號傳遞到細胞質傳遞器催化結構區(qū)域。反應調節(jié)子控制輸出信息，反應調節(jié)子是雙組分信號轉導系統中的第2個組分，含有1個或多個保守的 N 端接受器結構域(receiver domain) 和可變的 C 端效應器結構域 (effector domain)。組氨酸激酶的傳感器結構區(qū)域能夠檢測到體內外刺激，調控組氨酸激酶的活性。組氨酸激酶催化 ATP 依賴的特定的組氨酸自主磷酸化，然后反應調控蛋白催化組氨酸的磷酸基團轉移到它自身的天門冬氨酸殘基上，反應調控蛋白的磷酸化激活效應器結構域，從而產生一系列調控反應[17]。目前研究表明許多雙組分系統含有額外的調節(jié)伴侶蛋白[18]。雙組分系統信號的終止需通過反應調節(jié)子去磷酸化完成，在大多情況下，反應調節(jié)子的去磷酸化需要通過另一種蛋白-輔助磷酸酶的催化。雙組分調節(jié)控系統可調節(jié)細菌的多種代謝過程、細菌細胞周期、細菌間的信號交流和細菌毒力因子的表達[19]。

產氣莢膜梭菌VirS/VirR系統中的virR和virS基因位于操縱子中，被轉錄為單個的2.1 Kb mRNA[20]。VirR/VirS系統是產氣莢膜梭菌最重要和最有特點的1個雙組分系統。VirS/VirR系統由傳感器組氨酸激酶virS基因和反應調節(jié)因子virR基因組成。virS基因產物VirS在N末端具有6個假定的跨膜結構域。C末端結構域包含傳感器組氨酸激酶中常見4個基序中的3個。這些基序包括His-255殘基是其它傳感器激酶中自磷酸化位點[14]。virR的N-末端結構域含有保守的天冬氨酸殘基，其接受來自同源傳感器組氨酸激酶的磷酸基團[13-14]。

2 雙組分調控系統調控機制

2.1VirS/VirR系統對毒素的調控 VirR/VirS系統最早于1994年被鑒定為α-毒素基因plc，κ-毒素基因colA和θ-毒素基因pfoA的調節(jié)因子[13,20]。Northern分析顯示，3種毒素基因plc，pfoA和colA在轉錄水平受到VirR/VirS的正調控。VirS/VirR系統調節(jié)3種毒素基因的模式不同。pfoA基因具有2個啟動子，主要和次要啟動子，其中只有主要啟動子依賴于VirR/VirS。colA基因含有7個轉錄起始位點，其中2個依賴于VirR/VirS。plc基因僅具有1個啟動子，其由VirR/VirS部分調節(jié)[20]。由于在3種毒素基因的啟動子區(qū)域中未發(fā)現類似的結構，因此表明VirR/VirS系統不直接調節(jié)所有這些毒素基因的表達，并且在VirR/VirS調節(jié)網絡中存在更復雜的系統，可能涉及其他二級調節(jié)因子[20]。

之后研究發(fā)現，VR-RNA就是上述調控系統的1個二級調節(jié)因子。通過VR-RNA，VirS/VirR-VR-RNA級聯反應調控各種基因的表達[21]。因此，VirS/VirR系統是一種全局的基因調節(jié)因子，也是產氣莢膜梭菌最重要的調節(jié)因子之一。

除α-毒素基因外，產氣莢膜梭菌的主要毒素基因都位于質粒上。VirS/VirR系統雖位于染色體上，但它可以調節(jié)染色體和質粒上的基因。例如，A型產氣莢膜梭菌菌株13中質粒上的膠原粘附素基因(cna)和β-2毒素基因(cpb2)都受VirS/VirR系統調節(jié)。cna受該體系負調控，cpb2受正調控[22]。

cpb編碼產氣莢膜梭菌β毒素(CPB)，它是由B型和C型菌株產生的主要毒素，其引起出血性壞死性腸炎。據報道，C型菌株產生的CPB受VirS/VirR系統調控[23]。CPB是C型菌株必需的腸道毒力因子[24]。VirS/VirR通過調節(jié)CPB的產生致使C型菌株致病[23]。VirS/VirR系統是控制染色體和質粒上基因的關鍵調節(jié)因子。

VirS/VirR系統還可通過調節(jié)蛋白水解所需的蛋白酶活性來調節(jié)iota毒素的活性。Iota毒素是E型產氣莢膜梭菌產生的主要毒素。Iota毒素以無活性形式產生，需要蛋白酶的水解來激活。據報道，未成熟蛋白的裂解是由VirS/VirR依賴性蛋白酶來完成的[25]。

2.2VirS/VirR系統對其它基因的調控 VirS/VirR系統不但調節(jié)毒素基因，還對其它基因進行調節(jié)。研究人員通過差異顯示法對VirS/VirR調節(jié)的基因進行了鑒定，鑒定到3個克隆。通過核苷酸測序和Northern雜交實驗證實：1個質粒上的metB(胱硫醚γ-合成酶)，cysK(半胱氨酸合酶)和ygaG(假設蛋白)基因受負調控，而第2個質粒上的ptp(蛋白酪氨酸磷酸酶)和cpd(2′， 3′-環(huán)核苷酸2′-磷酸二酯酶)基因顯示受VirR/VirS系統的正調節(jié)。第3個質粒上的hyp7基因受到VirR/VirS系統的正調控，hyp7可激活產氣莢膜梭菌中colA和plc基因的轉錄，但不激活pfoA基因的轉錄。這些結果表明，全局調節(jié)系統VirR/VirS可以正向和負向調節(jié)毒素基因以外的各種基因，并且hypl基因可能編碼產氣莢膜梭菌毒素新的調節(jié)因子[26]。

據報道，VirS/VirR系統能感知細胞[27]：C型產氣莢膜梭菌與Caco-2細胞接觸，產氣莢膜梭菌會迅速上調毒素表達，而VirR突變體即使與菌株相同類型的細胞接觸也不能誘導毒素產生。這些數據表明，VirS/VirR系統對于感知環(huán)境(特別是環(huán)境中的細胞)和上調毒素產生是非常重要的[27]。

基因組分析表明產氣莢膜梭菌缺少參與氨基酸生物合成相關的基因[8]，因此，產氣莢膜梭菌在宿主體內生長，必需降解宿主組織并將產生的營養(yǎng)物質快速轉運到細菌細胞中。產氣莢膜梭菌的這種能力對于其在宿主中存活和生長是必不可少的，因此，它會依據不同環(huán)境來上調毒素及酶的產生。當產氣莢膜梭菌識別宿主細胞并準備降解宿主細胞時，通過與Caco-2細胞接觸而導致的毒素上調很明顯是其中的一種反應[28]，但尚不知道產氣莢膜梭菌是如何識別Caco-2細胞的。

2.3VirS/VirR和QS信號合成系統 雙組分系統毒力相關基因的表達受QS調控，該系統由QS信號合成系統和VirS/VirR雙組分系統組成。最近發(fā)現pfoA基因在細菌的對數生長中期短暫表達；此后，它的表達被迅速關閉，這表明存在一個自群體淬火(self-quorum quenching, sQQ)系統。添加靜止期培養(yǎng)上清液可誘導該sQQ系統發(fā)揮作用。sQQ系統是一種小分子物質，具有熱穩(wěn)定性，可通過超濾膜過濾篩選。此外，sQQ系統也可由濃度上與靜止期培養(yǎng)物相同的純乙酸和丁酸誘導，表明產氣莢膜梭菌產生的有機酸參與sQQ系統。在控制pH的分批培養(yǎng)物中，sQQ系統明顯減弱；pfoA的表達延長至對數生長后期，最終增加了1個數量級。此外，與上述有機酸相同pH條件下，鹽酸也可誘導sQQ系統發(fā)揮作用，靜止期培養(yǎng)上清液會抑制VirS/VirR調控的基因表達?？偟膩碚f，產氣莢膜梭菌的毒力因子的表達受到sQQ系統的下調，而sQQ系統是由主要酸性代謝物和酸性環(huán)境介導的，這表明采用控制pH將成為抵抗細菌毒力的一種新策略[29]。

Singh等[30]對靶定VirS/VirR雙組分系統的QQ肽進行了研究。根據構效關系分析結果他們設計了2種不同的類型QQ肽，這2種類型的肽在微摩爾濃度水平時會抑制pfoA的轉錄。利用QQ化療法有望治療由產氣莢膜梭菌引起的傳染病，如氣壞疽和壞死性腸炎。

3 VirR結合位點的鑒定

為了深入研究VirS/VirR的調節(jié)機制，鑒定VirR結合位點是一項重要工作。對pfoA啟動子區(qū)域的分析顯示在該區(qū)域中存在不完全的直接重復序列CCCAGTTNTNCAC[31]。使用定點誘變，DNase I足跡分析和凝膠移位分析顯示該序列為VirR結合基序，這些序列被指定為VirR框[32]。VirR能獨立地結合到位于pfoA基因上游的2個VirR框。此外，這些VirR框之間的距離和它們與pfoA啟動子的35區(qū)的距離對于VirR介導的激活作用是相當重要的。

研究人員對產氣莢膜梭菌菌株13基因組序列VirR框基序搜索發(fā)現，只有5個基因在其啟動子區(qū)域具有VirR結合位點，包括pfoA和編碼VR-RNA的vrr基因[8]。其它3個基因是ccp基因(它編碼半胱氨酸蛋白酶，a-clostripain)和2個假定基因virT和virU[7]，virT和virU兩者都編碼RNA調節(jié)分子[33]。已經證明這5個基因的VirR框都是功能性的[33]，VirR激活這5個基因的轉錄。

virT基因緊挨著ccp基因。對virT突變體及其互補衍生物進行分析表明，VirT RNA在轉錄水平上負調節(jié)pfoA和ccp[33]。不是所有已知序列的產氣莢膜梭菌菌株中都存在virT基因，它僅存在菌株13和ATCC3626中[34]。VirU的過表達可激活pfoA，ccp，vrr和virT的轉錄[33]。這兩種RNA調節(jié)子的調節(jié)水平并不強烈，它們對由VirS/VirR調控的基因的表達進行微調。

研究發(fā)現ATCC13124中的2個VirR框，SM101中的1個VirR框都與VirR結合[35]。這些基因大多數編碼假定蛋白質，但其中一些可能編碼調節(jié)性RNA分子，如VirT和VirU。研究還在位于質粒上的毒素基因啟動子區(qū)域發(fā)現了VirR框。例如，發(fā)現編碼產氣莢膜梭菌成孔毒素NetB基因上游具有VirR框。NetB的產生受VirS/VirR系統的調節(jié)，并且VirR與netB基因上游的VirR框結合[36]。在菌株JFP718中netE和netG毒素基因上游也存在VirR框[37]，它們的功能尚不清楚。NetB是禽類壞死性腸炎的關鍵毒力因子[38]。因此，VirS/VirR系統通過控制不同菌株中不同毒素的產生來控制不同致病力菌株的毒力。

4 展 望

隨著細菌基因組序列的公布，運用生物信息學的方法和系統性突變的方法己經成功鑒定幾種產氣莢膜梭菌毒素和酶的調控系統，并對其功能進行了研究。但是與其它致病菌相比，我們對該菌的毒力調節(jié)機制知之甚少。對艱難梭菌和肉毒桿菌的研究發(fā)現某些氨基酸、特定氨基酸混合物、葡萄糖和σ因子影響或抑制某些細菌毒素的產生[38-40]。產氣莢膜梭菌中也可能存在類似的毒素調控機制。因此，我們需要對產氣莢膜梭菌毒力調節(jié)機制進行更廣泛深入的研究，詳盡闡明毒力相關基因的調節(jié)網絡，為開發(fā)新型抗菌制劑提供新的靶點，進而全面地抵抗產氣莢膜梭菌感染。

利益沖突：無