一種側(cè)流試紙結(jié)合FAM重組酶聚合酶擴增(RPA)診斷布魯氏菌感染的方法

葛志毅，周建華，尚佑軍，李學(xué)瑞，劉永生，趙 鷺，孫晶晶，曹小安

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布魯氏桿菌(Brucella)引起的細菌性人獸共患病，有急性，亞急性和慢性幾種形式[1]。其病原布魯氏菌為革蘭氏陰性兼性細胞內(nèi)寄生菌[2]，可由口、鼻、咽喉、結(jié)膜等途徑侵害易感動物，造成妊娠母畜流產(chǎn)、死胎，及公畜睪丸炎等主要癥狀，同時伴有發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、淋巴結(jié)腫大等癥狀，對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成了巨大經(jīng)濟損失。同時作為一種典型的人獸共患病，對人類的健康也存在著極大的威脅[3]。

目前實驗室布魯氏菌病主要診斷技術(shù)為血清學(xué)檢測和PCR檢測，血清學(xué)檢測由于抗原蛋白分離純化的不同，其檢測抗體不同，易與其他檢測結(jié)果出現(xiàn)分歧[4]；PCR 檢測是目前有效的檢測方法，已經(jīng)發(fā)展出多種PCR檢測方法，如多重PCR、實時熒光定量PCR等，具備特異性高、檢測快速等優(yōu)點，但是由于各種PCR結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)的不同，還是存在著一定的誤差。本實驗所研究的方法為布病檢測提供了新的方法，增加了檢測的多樣性，同時該方法只需要在恒溫器中加入基因組短暫擴增后，取擴增產(chǎn)物在側(cè)流試紙上進行檢測即可。該方法相比于傳統(tǒng)RPA擴增產(chǎn)物熒光檢測而言[5]，更加方便，使得野外田間檢測成為一種可能。

1 材料與方法

1.1實驗試劑及儀器 試劑：RPA引物探針，Rehydration Buffer，RNase Inhibitor的dH2O，乙酸鎂，5×Extration Buffer，TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。側(cè)流試紙購自ABINGDON HEALTH公司，其商品名為Nucleic Acid Detection-Nucleic Acid Detection-PCRD。儀器：恒溫擴增儀、單道移液器、渦旋器，小型離心機。

1.2基因組提取 基因組提取參照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑說明書提取，主要原理是對組織進行研磨裂解，利用無水乙醇，Buffer RWA和Buffer RWB洗脫去除雜質(zhì)，離心洗脫DNA。其中特異性實驗中細菌基因組提取不需要組織研磨，只需將菌液離心后按照后續(xù)步驟繼續(xù)提取即可，同時標(biāo)準(zhǔn)布魯氏桿菌基因組為實驗室保存的M5基因。具體方法參考試劑說明書。

1.3引物與探針 根據(jù)布魯氏桿菌的特異基因為omp25(Accession:AY484523.1)保守序列設(shè)計引物與探針，具體見表1。

表1 針對布魯氏桿菌特異基因的保守序列設(shè)計的引物與探針
Tab.1 Primers and probes designed for conserved sequences of Brucella-specific genes

引物/探針名稱 引物/探針序列RPAFggtgttgaaggtgatgcaggttattcctgggccaaRPARbiotin-ccgcaataccagccgtgaggtacggcataacRPA-oligoFAM-ggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctc(THF)ct-gcgtgcccgcgtcgg-C3space

1.4RPA側(cè)流試紙反應(yīng)條件的優(yōu)化 RPA加樣體系：上、下游引物(10 μmol/L)各2.1 μL，RPA探針(10 μmol/L)0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，RNase Inhibitor的dH2O 11.2 μL，DNA樣本2 μL，混合后加入RPA酶管中震蕩混勻，再加入2.5 μL的乙酸鎂在加熱器上反應(yīng)，反應(yīng)后取擴增產(chǎn)物側(cè)流試紙檢測。

1.4.1最佳反應(yīng)溫度確定 加樣完成后，分別取標(biāo)準(zhǔn)陽性M5和沙門作為陰性的樣品在36 ℃、38 ℃、40 ℃ 3個溫度條件下反應(yīng)，反應(yīng)時間為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的10 min,反應(yīng)后取擴增產(chǎn)物側(cè)流試紙檢測。

1.4.2最佳反應(yīng)時間確定 同樣加樣完成后，分別取標(biāo)準(zhǔn)陽性M5和沙門作為陰性的樣品在5～30 min范圍內(nèi)反應(yīng)，(陽性分別設(shè)置5 min、10 min、20 min 3個時間梯度，陰性分別設(shè)置10 min、20 min、30 min 3個時間梯度)，反應(yīng)溫度為常規(guī)溫度38 ℃[6]，反應(yīng)后取擴增產(chǎn)物側(cè)流試紙檢測。

側(cè)流試紙檢測加樣體系為：取6 μL擴增產(chǎn)物，加入84 μL的5×Extration Buffer,充分混勻后，取75 μL滴至側(cè)流試紙反應(yīng)孔中，10 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.5特異性實驗 分別用沙門氏菌、大腸桿菌、衣原體、腸球菌、金色葡萄球菌以同樣基因組提取試劑盒以同樣的方法提取基因組，加入體系以最優(yōu)反應(yīng)條件擴增，反應(yīng)結(jié)束后用側(cè)流試紙檢測，驗證引物與探針的特異性。

1.6敏感性實驗 用布魯氏桿菌的M5基因組作為RPA的標(biāo)準(zhǔn)品，以10倍的梯度稀釋，加入體系以最優(yōu)反應(yīng)條件擴增，反應(yīng)結(jié)束后用側(cè)流試紙檢測，來驗證引物與探針的敏感性，布魯氏桿菌的M5基因組的初始濃度為4×104基因拷貝/μL(通過QPCR定量獲得)[7]，陰性對照為沙門氏菌基因組。

1.7臨床驗證 檢測104份樣品，37份為綿羊乳汁提取DNA，67份為羊組織提取DNA，經(jīng)過QPCR檢測，63個陽性，41個陰性(擴增沒有Cq值)，用RPA側(cè)流試紙進行檢測，驗證其與QPCR檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 RPA側(cè)流試紙反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1最佳反應(yīng)溫度的確定 按照上述方法進行檢測，側(cè)流試紙結(jié)果表明M5陽性樣品在36 ℃就能出現(xiàn)陽性條帶，38 ℃時陽性條帶很明顯，40 ℃同樣明顯。而陰性樣品檢測結(jié)果顯示在36 ℃，38 ℃條件下只出現(xiàn)質(zhì)控帶，不出現(xiàn)任何陽性條帶，但是在40 ℃條件下，會出現(xiàn)一條很弱很弱的陽性條帶。實驗結(jié)果如圖1所示。

In the test results from top to bottom on the left is the M5,36℃,38℃,and 40℃; From top to bottom on the right is a salmonella 36℃,38℃,and 40℃.圖1 最佳反應(yīng)溫度實驗側(cè)流試紙檢測結(jié)果Fig.1 Lateral flow test strips detect results of the optimal reaction temperature experiment

綜合考慮，為了充分保證實驗特異性，避免假陽性出現(xiàn)，以38 ℃為最佳反應(yīng)溫度。為了進一步說明實驗結(jié)果的真實性，對不同溫度的RPA擴增產(chǎn)物進行核酸電泳，其結(jié)果與側(cè)流試紙結(jié)果一致，在100～200 bp之間，陽性38 ℃和40 ℃有一條很明顯條帶，陰性40 ℃有一條很淺的條帶。實驗結(jié)果如圖2所示。

Note:From left to right is the Mark,M5 36℃,38℃,and 40℃, salmonella 36℃, 38℃,and 40℃.圖2 最佳反應(yīng)溫度實驗核酸電泳結(jié)果Fig.2 Nucleic acid electrophoresis detect results of optimum reaction temperature experiment

2.1.2最佳反應(yīng)時間的確定 同樣按照上述方法進行檢測，側(cè)流試紙結(jié)果表明M5陽性樣品在10 min就能出現(xiàn)明顯陽性條帶，20 min同樣如此。陰性樣品檢測結(jié)果顯示在10 min內(nèi)只出現(xiàn)質(zhì)控帶，而20 min和30 min時有一條很弱的陽性條帶。綜合考慮，還是以最大程度保證特異性為主，避免假陽性的存在，以反應(yīng)時間10 min作為最佳反應(yīng)時間。同樣用核酸PCR檢測擴增產(chǎn)物進行佐證，其結(jié)果與側(cè)流試紙檢測結(jié)果一致，結(jié)果如圖3所示。因此，本實驗為了確保最大程度檢測出陽性樣品，同時避免陰性樣品出現(xiàn)假陽性情況，將反應(yīng)條件38 ℃ 10 min作為最佳反應(yīng)條件。

Note:From left to right is the Mark,M5 5 min,10 min, and 20 min, salmonella 10 min, 20 min, and 30 min.圖3 最佳反應(yīng)時間實驗核酸電泳檢測結(jié)果Fig.3 Nucleic acid electrophoresis detect results of optimum reaction time experiment

2.2特異性實驗 特異性實驗結(jié)果表明：滴加至側(cè)流試紙10 min內(nèi)，只有M5陽性出現(xiàn)明顯陽性條帶，其他菌株及陰性均只出現(xiàn)質(zhì)控條帶，證明引物和探針存在高度特異性。同樣對其擴增產(chǎn)物進行核酸電泳，結(jié)果與側(cè)向流動試紙檢測結(jié)果一致。

2.3敏感性實驗 敏感性實驗結(jié)果表明：將標(biāo)準(zhǔn)DNA稀釋到10-4后(80個基因拷貝數(shù))，側(cè)流試紙仍有一條可見陽性帶，而到了10-5后(8個基因拷貝數(shù))，陽性條帶已經(jīng)很弱，所以其敏感性以達到10-4(80個基因拷貝數(shù))為準(zhǔn)，存在良好的敏感性。同樣擴增產(chǎn)物電泳，結(jié)果與側(cè)向流動試紙檢測結(jié)果一致。

2.4臨床驗證 用QPCR檢測了104個不同樣品，63個陽性，41個陰性(擴增沒有Cq值)，部分檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4 QPCR部分檢測樣品結(jié)果Fig.4 Partial results of QPCR detection of samples

對這些樣品進行RPA擴增，側(cè)流試紙進行檢測，其檢測結(jié)果為75個陽性，29個陰性，總的檢測結(jié)果統(tǒng)計如表2所示。

可知QPCR檢測出63份陽性，41份陰性；RPA檢測出75份陽性，29份陰性，即所有樣品中63份兩種方法檢測結(jié)果都為陽性，29份兩種檢測方法結(jié)果都為陰性，但部分QPCR檢測為陰性的樣本RPA檢測結(jié)果為陽性，RPA對臨床樣本的檢查更加敏感。

表2 兩種方法檢測結(jié)果統(tǒng)計
Tab.2 Test results of the two methods

樣本類型QPCRRPA陽性陰性陽性陰性綿羊乳汁2413316羊組織39284423

3 討 論

布魯氏菌病一直以來對我國的養(yǎng)羊業(yè)、養(yǎng)牛業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失，同時其作為一種重要的人獸共患病，嚴(yán)重威脅著牧民、養(yǎng)殖戶以及相關(guān)科研工作人員的健康安全。對其檢測和防控一直以來是一個主要的課題，目前，實驗室布魯氏病主要檢測診斷技術(shù)為血清學(xué)檢測和PCR檢測，兩種檢測方法各有優(yōu)缺點。本實驗所研究的方法為布病檢測提供了新的方法，增加了檢測的多樣性。

本實驗旨在提供一種新的布病快速檢測方法，同時為野外田間檢測提供一種可能，通過反應(yīng)體系條件優(yōu)化，特異性實驗，敏感性實驗以及與臨床QPCR檢測比較，最終確定該方法。平時只需要配置好RPA擴增體系，分裝到小管中，檢測時只需加入樣本DNA和醋酸鎂，恒溫器38 ℃反應(yīng)10 min后，混入側(cè)流試紙體系中，取適量加入側(cè)流試紙讀取結(jié)果即可，這為田間檢測提供了一種可能。

本實驗在不同反應(yīng)溫度、不同反應(yīng)時間內(nèi)判斷最佳反應(yīng)結(jié)果，設(shè)計特異性，敏感性實驗及臨床驗證實驗，最終確定該方法。需要指出的是，加樣體系是目前最常規(guī)的加樣體系，對實驗結(jié)果不會有太大影響，無需過多調(diào)整，最主要的是反應(yīng)體系調(diào)整，反應(yīng)時間和溫度的不同往往會影響到實驗的結(jié)果，出現(xiàn)假陽性的情況，所以確定一個最適的反應(yīng)條件至關(guān)重要。本實驗確定最佳反應(yīng)時間和最佳反應(yīng)溫度時，是以考慮最大程度保證陽性樣本的檢出，同時避免假陽性的出現(xiàn)為準(zhǔn)，因此本實驗具有很強的特異性，但是同時也造成敏感性不是特別高，同時檢測樣品時有出現(xiàn)漏檢的情況，因此可以根據(jù)實際情況調(diào)整反應(yīng)條件，同時注意樣品體系的充分混勻。

本方法特異性強，操作簡單、快速、不過多依賴實驗儀器，提供了一種新的布病快速檢測方法，同時為田間布病檢測提供一種可能，但是實驗規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)化方面還需要進一步完善。

利益沖突：無