綠肥套作對植煙土壤微生物群落功能多樣性的影響

趙冬雪，王盼盼，常春麗，李金秋，王晶英，敖 紅

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

烤煙是我國重要的經(jīng)濟作物，連作現(xiàn)象十分普遍[1]?？緹熼L期連作產(chǎn)生了一系列的生產(chǎn)問題，特別是造成土壤養(yǎng)分失調(diào)、土壤生物化學(xué)過程受阻、土壤有害物質(zhì)逐年積累導(dǎo)致烤煙生長受抑制，煙葉產(chǎn)量品質(zhì)降低等[2-4]，可以看出長期連作的多重負面疊加效應(yīng)嚴重影響烤煙生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[5]。在土壤生物區(qū)系中土壤微生物群落是最重要的成分之一[6-8]，土壤環(huán)境條件變化會引起土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、數(shù)量、生理生化活性的迅速改變[9]，常用作土壤質(zhì)量和土壤生態(tài)系統(tǒng)良好的重要指標[10]?，F(xiàn)階段的研究多集中在植煙土壤微生物酶活性、植煙土壤微生物量碳、植煙土壤細菌數(shù)量等方面，而對植煙土壤微生物碳代謝的研究則鮮見報道。施用綠肥是農(nóng)業(yè)中重要和較為普遍的增產(chǎn)手段[11]。綠肥作為一種重要的有機肥料，可以改良土壤結(jié)構(gòu)、增強土壤肥力和提高作物產(chǎn)量[12-14]。有研究表明，施入綠肥可對土壤養(yǎng)分的循環(huán)和微生物群落多樣性起積極作用[15-18]。

本試驗通過Biolog技術(shù)對牡丹江煙草研究所試驗地套作綠肥后的煙草生長團棵期、成熟期的土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行研究，揭示綠肥對植煙土壤微生物碳代謝的影響，為煙草種植過程中的綠肥套作模式提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地在黑龍江省牡丹江市煙草科研所試驗田，試驗田地處寒帶東部，東經(jīng) 128°02′～131°18′，北緯 43°24′～45°59′ 。全年日照時間約 2 400 h，年平均氣溫6.1 ℃，無霜期 140 d，年降水量約 580 mm。供試土壤為暗棕土。試驗地塊土壤肥力均勻一致，土壤質(zhì)地為黏壤土，土壤類型為河淤土，土壤pH值7.2 ，碳、氮、硫含量分別為 1.37%，0.26%，0.07%，有機質(zhì)含量為 23.1 g/kg、堿解氮為89.55 mg/kg、有效磷為 21.59 mg/kg、速效鉀為 165.45 mg/kg。

1.2 供試材料

供試煙草：龍江911。供試綠肥：黑麥草(LoliumperenneL.)、草木犀(Melilotusofficinalis(L.)Pall.)。上述供試材料均由黑龍江省牡丹江市煙草研究所提供。

1.3 試驗設(shè)計

試驗為定位試驗，隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理 3重復(fù)， 9 行小區(qū)，6 m行長，壟距 1.1 m，每個小區(qū)面積 59.4 m2，共計用地 0.11 hm2。試驗地 2016 年烤煙與綠肥套作，烤煙5 月移栽，綠肥 7 月下旬播種。具體處理為：烤煙與黑麥草套種；烤煙與草木犀套種；不種綠肥(CK)。烤煙采收結(jié)束后，將煙稈清理， 2016 年 11 月初將綠肥翻耕， 2017 年 4 月起壟， 5 月烤煙移栽。

1.4 土壤樣品采集

2017 年6月(團棵期)、10月(成熟期)按五點取樣法選取植株，去掉表層土壤，用鐵鏟垂直向下挖取 0 ～20 cm土壤。剔除土壤樣品中的雜物，裝入封口袋，將樣品置于冰盒內(nèi)帶回實驗室。過篩，存放于 4 ℃冰箱，用于Biolog-Eco板測定。

1.5 土壤微生物群落功能多樣性分析

應(yīng)用Biolog微平板(ECO Micro Plate)測定土壤微生物對碳源的利用情況。參考Classen等[19]的方法，現(xiàn)將土壤樣品在 25 ℃下活化 24 h，稱取相當于 10 g烘干土質(zhì)量的鮮土加入盛有90 mL滅菌的NaCl溶液中，加無菌封口膜，將樣品振蕩 1 min，然后冰浴 1 min，反復(fù) 3 次。靜置 2 min再稀釋，逐漸稀釋為 10-2和 10-3的懸浮液。向微板每孔中加人 150 μL 的10-3的土壤懸浮液，將微孔板置于 25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng) 9 d，分別在0，24，48，72，96，120，144，168，192，216，240，264 h用酶標儀(Sunrise remote，TECAN)測定 590 nm處吸光值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物對碳源的利用可以用平均顏色變化率(Average well color development，AWCD，即RAWCD)來描述，即對單一碳源的利用情況，其計算方法[20]中，Bi為所測定的第i個碳源孔的光密度值，A為對照孔的光密度值。采用微平板培養(yǎng) 96 h的數(shù)據(jù)進行分析，此時大部分的微生物均已參與碳源的代謝過程，能清晰地描述微生物群落的輪廓。采用均勻度指數(shù)(H)、Simpson指數(shù)(D)和優(yōu)勢度指數(shù)(U)來描述土壤微生物群落對碳源的代謝多樣性。其中，Ei為第i孔的吸光值與平板吸光值總和的比率，ni是第i孔的吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Excel 2003，單因素方差分析和主成分分析使用SPASS。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠肥及植煙不同時期根際土壤微生物利用全部碳源的動力學(xué)特征

平均顏色變化率可以描述土壤微生物群落對碳源的利用程度，表征土壤中微生物代謝活性。圖 1 顯示，時間增加，土壤微生物群落對碳源的利用總量逐漸增長直至平緩，但套作不同綠肥土壤微生物群落 AWCD 增長趨勢不同。 0～96 h 內(nèi)，AWCD 值快速增長，說明土壤微生物對碳源的代謝能力極強，且團棵期的處理AWCD值顯著高于成熟期處理。培養(yǎng)時間達到96～192 h后AWCD 緩慢增加直至趨于穩(wěn)定。其中團棵期、成熟期套作草木犀的處理AWCD值增長最快，整個培養(yǎng)過程中土壤微生物碳代謝活性最強。對照處理顯著低于套作綠肥處理，說明套作綠肥增強了土壤微生物群落對碳源代謝的能力。

Ⅰ.團棵期黑麥草；Ⅱ.團棵期草木犀；Ⅲ.團棵期對照；Ⅳ.成熟期黑麥草；Ⅴ.成熟期草木犀；Ⅵ.成熟期對照。不同小寫字母的表示處理間 5%水平差異。表1、圖2-3同。

Ⅰ. RosettestageLolium;Ⅱ. RosettestageMelilotusofficinalis;Ⅲ. Rosettestage control;Ⅳ. Maturity stageLolium;Ⅴ.Maturity stageMelilotusofficinalis;Ⅵ.Maturity stage control. Different letters indicate 5% significant difference. The same as Tab.1,Fig.2-3．

圖1 土壤微生物群落隨著培養(yǎng)時間的變化
Fig.1 AWCD changes of different treatmentsduring different incubation times

2.2 不同綠肥及植煙不同生長時期土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

多樣性指數(shù)表征土壤微生物群落對不同碳源的利用程度，可以描述土壤微生物群落整體的變化。Shannon指數(shù)可以描述土壤中微生物群落的豐富程度，Simpson指數(shù)可以描述土壤微生物群落中常見的物種的優(yōu)勢程度，Mclntosh指數(shù)可以描述土壤微生物群落的物種的均一程度。從表 1 可以看出,套作黑麥草、草木犀與對照相比在團棵期Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Mclntosh指數(shù)差異均達顯著水平(P<0.05)，說明套作綠肥后在團棵期土壤微生物群落豐富度、常見物種的優(yōu)勢度和均一性都發(fā)生較大的變化。套作黑麥草、草木犀后在成熟期，土壤微生物群落物種豐富度及均一性變化較為明顯。套作草木犀Simpson指數(shù)與對照差異顯著，但套作黑麥草Simpson指數(shù)與對照無顯著差異，說明套作不同種類的綠肥對土壤微生物群落常見物種的優(yōu)勢度有顯著影響。團棵期各處理的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Mclntosh指數(shù)均顯著高于成熟期各處理，說明在團棵期土壤微生物群落豐富度、優(yōu)勢度、均一性上與成熟期差異顯著。此外結(jié)果還顯示,套作草木犀各項指數(shù)均高于套作黑麥草。此結(jié)果與根際土壤微生物AWCD的變化一致。

表1 植煙土壤微生物群落在培養(yǎng)96 h 時AWCD值和多樣性指數(shù)Tab.1 AWCD and diversity index of microbial communities in tobacco growing soil at 96 h

2.3 不同綠肥及植煙不同時期土壤微生物對6 大類碳源的利用強度

31 種碳源分為6大類，分別為胺類、氨基酸類、羧酸類、其他化合物類、聚合物類和糖類。套作不同綠肥的土壤微生物群落對不同碳源的代謝強度如圖 2。從圖中可以看出，不同綠肥及不同生長時期土壤微生物對糖類、羧酸類和氨基酸類等碳源的利用程度明顯高于其他另 3 類碳源。套作黑麥草和草木犀在團棵期土壤微生物群落對氨/胺類、氨基酸類、羧酸類和糖類的利用程度有顯著性差異。團棵期土壤微生物對糖類、其他化合物和氨基酸的利用程度明顯高于成熟期。成熟期對照處理土壤微生物群落對其他化合物類和糖類的利用程度最低。

2.4 不同綠肥及植煙不同時期土壤微生物對碳源利用多樣性的主成分分析

將不同樣本的多元變量重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合變量，這些綜合變量盡可能多的反映原來變量的信息的統(tǒng)計方法叫主成分分析。在空間中，點的位置反映不同生長時期套作不同綠肥的土壤微生物群落的多樣性和對碳源利用的代謝程度。應(yīng)用主成分分析在 31 種因子中提取了3 個主成分因子，其分別解釋所有變量43.04 %，15.23%，9.46%，3種主成分的累計貢獻率 64.89%，可以解釋變量的絕大部分信息(表2)。

圖2 套作不同綠肥土壤微生物對不同碳源的利用水平Fig.2 Utilization of different carbon sources by soil microorganisms under intercropping with different green fertilizers

表2 主成分的貢獻率和累計貢獻率Tab.2 Principal component contribution rate and accumulated contribution rate %

不同生長時期和套作不同綠肥在PC軸上差異顯著如圖3。在PC1軸上團棵期在正方向上，黑麥草得分系數(shù)為 4.52～6.55 ，草木犀得分系數(shù)10.66～11.28，對照得分系數(shù)3.89～4.69。成熟期主要分布在負方向上，得分系數(shù)為-1.85～0.16。在PC2軸上團棵期套作黑麥草正方向上，得分系數(shù)為 2.05～4.78，套作草木犀和空白處理在負方向上，得分系數(shù)分別為-3.79～-1.20和-0.75～-0.44，成熟期套作黑麥草和空白集中分布在原點附近。不同生長時期和綠肥在PC軸上呈現(xiàn)不同空間分布，說明不同生長時期和不同綠肥對碳源的利用種類和程度存在差異。

圖3 套作不同綠肥的土壤微生物群落對碳源利用的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon source utilization by soil microbial communities under intercropping different green manure

碳源化學(xué)類別Chemical guild碳源類型Carbon source主成分1PC1主成分2PC2氨基酸甘氨酰-L-谷氨酸-0.087 0.840?Amino acidL-蘇氨酸0.4600.218L-絲氨酸0.683-0.137L-苯丙氨酸0.635-0.204L-天門冬酰胺0.733-0.032L-精氨酸0.897?0.107羧酸D-蘋果酸0.887?-0.024Carboxylic acidα-丁酮酸0.883?0.105衣康酸-0.0220.470γ-羥丁酸-0.1930.3654-羥基苯甲酸0.2800.5092-羥基苯甲酸0.537-0.063D-半乳糖醛酸0.418-0.143D-半乳糖酸 γ-內(nèi)酯0.1370.222D-葡糖胺酸0.602-0.378其他化合物1-磷酸葡萄糖0.946?-0.105MiscellaneousD,L-α-磷酸甘油0.868?0.416丙酮酸甲酯0.691-0.299聚合物土溫 400.7500.289Polymer土溫 800.6470.061α-環(huán)式糊精0.587-0.504肝糖0.7150.501糖類D-纖維二糖0.1180.799?Carbohydrateα-D-乳糖0.6550.059β-甲基-D-葡萄糖苷0.343-0.262D-木糖/戊醛糖0.6370.498i-赤蘚糖醇0.871?0.213D-甘露醇0.7350.128N-乙酰-D-葡萄糖氨0.904?-0.076氨/胺類腐胺0.772-0.395Amine/amide苯乙胺0.949?-0.188

注：*為載荷因子大于0.79與主成分顯著相關(guān)。

Note:*Load factor greater than 0.79 is significantly correlated with principal component.

載荷因子表示主成分與碳源的正相關(guān)性，載荷因子越高表示該種碳源對主成分的影響越大。載荷因子大于0.79表現(xiàn)為與主成分1顯著相關(guān)的碳源分別為糖類2種、其他化合物類2種、羧酸類2種，氨/胺類1種、氨基酸類1種(表3)。與主成分 2 顯著相關(guān)的碳主要為氨基酸類1種、糖類1種，由此可知，糖類、其他化合物類和羧酸類碳源是引起土壤微生物群落代謝差異的主要碳源類型，即微生物碳源代謝多樣性的差異主要體現(xiàn)在糖類、其他化合物類和羧酸類。

3 討論與結(jié)論

分析結(jié)果顯示，不同生長時期、套作不同種類綠肥的土壤微生物對碳源的利用包括極速生長階段、緩慢生長階段、穩(wěn)定生長階段。AWCD 值隨時間的變化直觀反映了微生物群落對碳源代謝的速度和反應(yīng)最后到達的程度，平均顏色變化率越大，表示土壤微生物群落代謝活性越高。本研究中，團棵期、成熟期的土壤微生物群落AWCD均為套作綠肥處理高于對照處理，且在整個培養(yǎng)過程中套作草木犀的 AWCD 顯著高于其他處理。本試驗套作綠肥對植煙根際微生物群落的影響結(jié)果顯示，套作綠肥后植煙團棵期和成熟期與對照相比，其土壤微生物在微平板上的平均顏色變化率(AWCD)和微生物代謝多樣性指數(shù)差異較大，說明套作綠肥對土壤微生物有顯著影響，這與劉勇軍等[21]提出的施用不同種類的有機物料在某一時期能明顯提高煙草根際微生物活性和多樣性的結(jié)果一致。有研究表明，套作綠肥能提高植煙上部煙可用性，并提升植煙土壤供肥能力[22]?？瞻滋幚淼耐寥繟WCD和微生物多樣性指數(shù)低于套作綠肥處理，說明煙草連作對微生物多樣性影響較大，不利于土壤養(yǎng)分的可持續(xù)性發(fā)展，現(xiàn)實生產(chǎn)中應(yīng)避免烤煙連作。土壤微生物群落豐富程度、優(yōu)勢度和均一性均反映土壤微生物群落多樣性情況和土壤微生物結(jié)構(gòu)的差異[23]。此次研究中，套作綠肥顯著提高了土壤微生物群落豐富度和優(yōu)勢度，說明綠肥能提高植煙土壤優(yōu)勢菌群。原因可能是土壤不僅受到植煙根系分泌物的影響[24]，而且還受到綠肥植物殘茬還田對土壤養(yǎng)分的影響。有研究表明，植物根系及其殘體向土壤中分泌大量有機物質(zhì)[25]，土壤微生物碳代謝變化可能是由于套作綠肥改變了土壤有機質(zhì)含量和組成。另外由于根系分泌物的黏附作用，套作還可以改善土壤的理化性質(zhì)，促進微生物菌群的繁殖[26]，從而改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。

主成分分析表明，受環(huán)境因子影響，對綠肥比較敏感的碳源類型主要為糖類、其他化合物類和羧酸類。有研究表明，土壤微生物群落在煙草栽培過程中會發(fā)生變化[27]。有關(guān)作物輪作和休耕的研究表明，一般適合輪作[28]的栽培作物包括禾本科和豆科植物的代表[29]。本試驗中，黑麥草為禾本科植物，草木犀為豆科植物。草木犀與黑麥草相比對氮的固持能力增強，提高了土壤C/N，微生物會對土壤中過量的氮素進行固定，提高了土壤的氮素供應(yīng)能力，也為微生物提供更多生長所需氮源的類型，進而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

土地的利用方式對土壤微生物群落組成有重要影響，也會對微生物群落變化產(chǎn)生影響[30]。本試驗中團棵期土壤微生物對碳源的利用能力和種類顯著高于成熟期，其原因可能是在團棵期與成熟期相比，更加適宜的土壤溫度和土壤濕度，是微生物生長和繁殖的優(yōu)良環(huán)境，進而增強了微生物代謝活性。同時綠肥的腐解速度不同，受光照等環(huán)境因素影響也不同，可能也影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤微生物的多樣性。

套作綠肥顯著提高微生物群落多樣性并增強了植煙土壤微生物對碳源的利用能力，草木犀對土壤微生物的影響高于黑麥草，植煙套作綠肥建議用豆科植物。由于Biolog-Eco微平板技術(shù)對微生物群體活性依賴較大，對不能利用Biolog碳源底物的群體無法檢測，作者建議可以采用克隆文庫和高通量測序技術(shù)等研究方法深入闡述套作綠肥對土壤中難培養(yǎng)微生物的影響，為后續(xù)綠肥與煙草套作栽培模式的應(yīng)用提供堅實依據(jù)。