HA標(biāo)簽的水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因植物雙元表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

王曉靜，孫林靜，孫 玥，張融雪，李軍玲，閆雙勇，蘇京平

(天津市農(nóng)作物研究所 天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

水是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，水孔蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類可以通透水分和其他中性小分子的膜內(nèi)在蛋白。根據(jù)氨基酸序列同源性比較，在大多數(shù)植物物種中，水孔蛋白被分成4類，分別是質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasma membrane intrinsic protein，PIP)、液泡膜內(nèi)在蛋白(Tonoplast intrinsic protein，TIP)、NOD26類似內(nèi)在蛋白(NOD26-like intrinsic protein，NIP)和小分子質(zhì)量堿性內(nèi)在蛋白SIP(Small and basic intrinsic protein，SIP)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通常PIP和TIP具有較高的水分運(yùn)輸活性，而大部分NIP和SIP除運(yùn)輸少量水分子外，對(duì)中性小分子物質(zhì)具有良好的通透能力[1]。

在植物中，首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的水孔蛋白是液泡膜水孔蛋白γ-TIP，并通過(guò)爪蟾卵母細(xì)胞體系證明它是一個(gè)水通道蛋白[2]。水稻中共有4類水孔蛋白，其中PIP有11個(gè)，TIP有10個(gè)，NIP和SIP分別有10個(gè)和2個(gè)[3]。PIP是很重要的一類水孔蛋白，根據(jù)N-末端和C-末端的長(zhǎng)度及活性不同，PIP又可以分為PIP1和PIP22個(gè)亞類，其中水稻中的PIP1有3個(gè)，PIP2有8個(gè)。相比PIP1，PIP2有較長(zhǎng)的C末端與較短的N末端。PIP2個(gè)亞類通透水分和小分子的功能也有所差異，PIP1家族通透水分的能力較低，但PIP2家族有較強(qiáng)的水分運(yùn)輸效率[4]。

有研究證明，OsPIP2;7基因在水分快速轉(zhuǎn)運(yùn)、體內(nèi)水分平衡、硼離子毒害的耐受性以及冷害耐受性有重要作用[5-7]。為了深入探索OsPIP2;7基因的生物學(xué)功能，需要利用OsPIP2;7的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行功能研究。本試驗(yàn)通過(guò)將3×HA標(biāo)簽連接在OsPIP2;7氨基酸的C端，得到pHB-OsPIP2;7-3×HA植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)中花11進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到過(guò)表達(dá)OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因植株，將為研究OsPIP2;7的生物學(xué)新功能提供試驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種：中花11，由天津市農(nóng)作物研究所提供。

菌株和質(zhì)粒：克隆載體T-Vector pMD 19 (Simple)購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105、質(zhì)粒pHB由上海市植物生理生態(tài)研究所惠贈(zèng)。

試劑和酶：Taq酶和各種內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒及其他各種生化試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑Rever Tra Ace α購(gòu)自Toyobo公司；HA抗體購(gòu)自Abmart公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1OsPIP2;7-3×HA基因片段的克隆 根據(jù)NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的水稻OsPIP2;7的全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1，PIP2-F、PIP2-R)，為了構(gòu)建載體及鑒定載體的便利性，設(shè)計(jì)引物時(shí)分別引入Hind Ⅲ和PstⅠ酶切位點(diǎn)。采用嵌套PCR的方法，根據(jù)HA標(biāo)簽蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物(表1，HA-R1、HA-R2、HA-R3)，同時(shí)最后一條引物引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)。按照TRIzol(Invitrogen)使用說(shuō)明書操作，從水稻的三葉齡葉片中提取植物總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。取2 μg提取的總RNA，根據(jù)Rever Tra Ace α(Toyobo)說(shuō)明書操作，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物保存于-20 ℃。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板，PIP2-F、PIP2-R為引物對(duì)OsPIP2;7進(jìn)行擴(kuò)增。將上一步的PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板，PIP2-F、HA-R1為引物進(jìn)行嵌套PCR的第1輪擴(kuò)增反應(yīng)。按照同樣的方式，分別以PIP2-F和HA-R2、PIP2-F和HA-R3為引物進(jìn)行嵌套PCR的第2輪和第3輪擴(kuò)增反應(yīng)。3輪反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到T-Vector pMD 19 (Simple)上，委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將pHB載體用Hind Ⅲ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，電泳，切膠回收帶酶切位點(diǎn)的pHB片段。將pMD19-T-OsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，電泳，切膠回收帶酶切位點(diǎn)的OsPIP2;7-3×HA目的條帶。將帶黏性末端的OsPIP2;7-3×HA與pHB載體連接，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后挑取單克隆振蕩培養(yǎng)，提取的質(zhì)粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切檢測(cè)陽(yáng)性克隆。委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行確認(rèn)，最后將正確質(zhì)粒命名為pHB-OsPIP2;7-3×HA(圖1)。

圖1 植物表達(dá)載體pHB-OsPIP2;7-3×HA結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of plant expression vector pHB-OsPIP2;7-3×HA

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定 將構(gòu)建好的pHB-OsPIP2;7-3×HA載體用凍融交替法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA 105感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆振蕩培養(yǎng)24～36 h，用引物PIP2-F和HA-R3進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性克隆。將得到的陽(yáng)性農(nóng)桿菌用添加乙酰丁香酮的AAM液體培養(yǎng)基重懸后，對(duì)粳稻品種中花11成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行侵染。將侵染后的愈傷組織進(jìn)行不同抗生素篩選，篩選時(shí)用羧卞青霉素抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，用潮霉素作為陽(yáng)性愈傷組織的篩選劑，得到的陽(yáng)性愈傷組織經(jīng)過(guò)預(yù)分化與分化后生綠色芽，待芽長(zhǎng)至2～3 cm后放入生根培養(yǎng)基中壯苗。選取發(fā)育良好的生根植株(以中花11為對(duì)照)，用CTAB法提取植株的基因組DNA，潮霉素引物(表1，HYG-F、HYG-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。

表1 擴(kuò)增OsPIP2;7-3×HA與HYG基因的PCR特異引物序列Tab.1 The sequences of primers for amplification of OsPIP2;7-3×HA and HYG

注： 小寫字母為酶切位點(diǎn)序列。

Note:Small case letters are the sequence of enzyme sites.

1.2.4 RNA水平上鑒定轉(zhuǎn)基因植株 提取1.2.3中使用潮霉素引物篩選到的OsPIP2;7水稻轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的RNA，使用Rever Tra Ace α進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，目的基因OsPIP2;7的引物(P27RT-F和P27RT-R)與管家基因OsUBI的引物(UBIRT-F和UBIRT-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選RNA水平上過(guò)表達(dá)OsPIP2;7的水稻轉(zhuǎn)基因植株。反應(yīng)體系為20 μL，包括:ddH2O 12.5 μL、10×Buffer(含20 mmol/L Mg2+) 2 μL、引物(10 μmol/L)2 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 1 μL、Tag DNA聚合酶(2 U/μL) 0.5 μL、DNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)或者32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.5 膜蛋白的提取 液氮凍存水稻葉片組織研成粉末，倒入加有0.5 mL 裂解緩沖液(150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 值7.4, 1%V/V10 mmol/L PMSF)的離心管內(nèi)。將離心管放冰水浴，加入等體積預(yù)冷的稀釋緩沖液(300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH值 7.4, 4%V/VTriton X-114)，總體積1 mL。振蕩完畢后離心管放冰水浴10 min。4 ℃，12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新管，棄沉淀。將裝有上清裂解液的小管置于37 ℃水浴，不時(shí)振蕩，孵育20 min后，溶液分為兩相。12 000 r/min離心5 min，吸取上層水相，棄去。加入0.5 mL預(yù)冷的稀釋緩沖液與下層油狀相混合，振蕩后冰水浴10 min。將含膜蛋白的油狀下層相轉(zhuǎn)移到新管，加入9倍體積的預(yù)冷的丙酮，-20 ℃過(guò)夜。4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄上清，干燥沉淀，加入100 μL水后進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

1.2.6 蛋白免疫印跡 SDS-PAGE 采用Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Bad)垂直電泳系統(tǒng)。濃縮膠濃度為3%，分離膠濃度為12%，凝膠厚度為0.75 mm。將定量后的蛋白質(zhì)溶液加入上樣孔中，每孔加蛋白30 g進(jìn)行電泳(電泳緩沖液為：3.03 g/L Tris, 14.4 g/L Gly, 1 g/L SDS)。電泳條件為：100 V電泳15 min，150 V至電泳結(jié)束，時(shí)間為1.0～1.5 h。

轉(zhuǎn)膜：將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液(3.03 g/L Tris, 14.4 g/L Gly, 200 mL/L甲醇)中，期間準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所用的3 M濾紙和PVDF膜。首先將PVDF膜在甲醇中浸泡數(shù)秒，再浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，3 M濾紙也浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中。應(yīng)用Mini-PROTEAN Ⅱ Cell (Bio-Bad)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為：100 V濕轉(zhuǎn)1 h。

免疫印跡：脫脂奶粉封閉1 h，1∶3 000 anti-HA (Abmart)抗體孵育2 h，PBST溶液洗3遍，每遍10 min。二抗(HRP-conjugated secondary antibody, Santa Cruz)孵育1 h，PBST洗3遍，每遍10 min。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，將HRP底物ECL發(fā)光液(Pierce)1∶1等體積混合，將混合物覆蓋在PVDF膜表面，搖晃均勻并反應(yīng)1～2 min，保鮮膜將PVDF膜包好后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Chemi DocTM XRS+(Bio-Rad)掃描并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPIP2;7-3×HA基因片段的克隆

以水稻全長(zhǎng)cDNA第一鏈為模板，使用PIP2-F和PIP2-R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，片段大小為882 bp(圖2-A)。嵌套PCR的3輪擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，片段大小分別為911，937，969 bp(圖2-B)，與預(yù)期片段大小一致。將嵌套PCR的終產(chǎn)物切膠回收后，與T-Vector pMD 19 (Simple)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得陽(yáng)性克隆，測(cè)序后經(jīng)與NCBI上公布的目的基因OsPIP2;7與HA標(biāo)簽蛋白的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，OsPIP2;7-3×HA基因片段克隆正確。

A. 以PIP2-F和PIP2-R為引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果；B. 嵌套PCR的擴(kuò)增結(jié)果。HA1. 以PIP2-F和HA-R1為引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果；HA2.以PIP2-F和HA-R2為引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果；HA3. 以PIP2-F和HA-R3為引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M. 分子質(zhì)量標(biāo)記DL2000。

A. PCR results ofOsPIP2;7when usingPIP2-F andPIP2-R as primers; B. PCR results of nested PCR. HA1. PCR results ofOsPIP2;7-3×HAwhen usingPIP2-F andHA-R1 as primers; HA2.PCR results ofOsPIP2;7-3×HAwhen usingPIP2-F andHA-R2 as primers; HA3. PCR results ofOsPIP2;7-3×HAwhen usingPIP2-F andHA-R3 as primers. M. Molecular Marker DL2000.

圖2OsPIP2;7-3×HA基因片段的PCR擴(kuò)增
Fig.2 PCR amplification ofOsPIP2;7-3×HAgene segment

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

含目的基因質(zhì)粒pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA及植物雙元表達(dá)載體pHB經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切(圖3-A，B)、酶切產(chǎn)物切膠純化后，于16 ℃連接3 h，產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)，挑取卡那抗生素平板上的單菌落進(jìn)行陽(yáng)性重組子的篩選及鑒定。Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示2條帶，其中目的基因片段大小為969 bp(圖3-C)。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，pHB-OsPIP2;7-3×HA植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

將pHB-OsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA 105后，用PIP2-F和HA-R3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠結(jié)果顯示目標(biāo)條帶與預(yù)期結(jié)果一致(圖3-D)，表明所構(gòu)建的pHB-OsPIP2;7-3×HA載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

A. pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切；B. pHB空載體用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切；C. pHB-OsPIP2;7-3×HA陽(yáng)性克隆用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切；D. pHB-OsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105后，用引物PIP2-F和HA-R3擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。1. pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒酶切結(jié)果；2.pHB空載體酶切結(jié)果；3. pHB-OsPIP2;7-3×HA陽(yáng)性克隆酶切結(jié)果；4. 農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入pHB空載體后的PCR擴(kuò)增結(jié)果；5. 農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入pHB-OsPIP2;7-3×HA載體的陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增結(jié)果。M1. 分子質(zhì)量標(biāo)記DL2000；M2.分子質(zhì)量標(biāo)記DL5000。

A. Restriction enzyme identification ofHind Ⅲ andXbaⅠ；B. Restriction enzyme identification ofHind Ⅲ andXbaⅠ；C. Restriction enzyme identification ofHind Ⅲ andXbaⅠof a positive pHB-OsPIP2;7-3×HAclone; D. PCR results of the transformed pHB-OsPIP2;7-3×HAinto theAgrobacteriumstrains of EHA 105 when usingPIP2-F andHA-R3. 1. Enzyme identification of pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA; 2.Enzyme identification of pHB empty vector;3.Enzyme identification of pHB-OsPIP2;7-3×HA; 4. PCR results of the transformed pHB into theAgrobacteriumstrain; 5. PCR results of the transformed pHB-OsPIP2;7-3×HAinto theAgrobacteriumstrain. M1. Molecular Marker DL2000. M2.Molecular Marker DL5000.

圖3 植物表達(dá)載體pHB-OsPIP2;7-3×HA的構(gòu)建
Fig.3 Construction of plant expression vector pHB-OsPIP2;7-3×HA

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測(cè)

2.3.1 潮霉素篩選OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻 提取23個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻植株的全基因組DNA，用潮霉素引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，除了#1、#16單株沒有條帶，其余植株均擴(kuò)增出550 bp的預(yù)期片段，對(duì)照植株中花11中沒有出現(xiàn)電泳條帶(圖4)，符合預(yù)期結(jié)果。說(shuō)明pHB-OsPIP2;7-3×HA載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入水稻的基因組中。

2.3.2 篩選OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻在RNA水平表達(dá)上升的株系 提取12株潮霉素陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因水稻總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈的cDNA為模板，管家基因OsUBI的表達(dá)量為對(duì)照，通過(guò)半定量PCR的方法來(lái)檢測(cè)OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻不同植株的OsPIP2;7表達(dá)量。半定量PCR結(jié)果顯示，#12、#13、#19、#20植株的OsPIP2;7的表達(dá)量比中花11高很多(圖5)，成功得到在RNA水平上過(guò)表達(dá)OsPIP2;7的轉(zhuǎn)基因水稻。

ZH11. 陰性對(duì)照植株中花11；1-23. 轉(zhuǎn)基因水稻不同株系；M. 分子質(zhì)量標(biāo)記DL500。ZH11. Zhonghua 11 as negative control; 1-23. Different lines of transgenic rice； M. Molecular marker DL500.

ZH11. 陰性對(duì)照植株中花11；11、12、13、15、17、19、20. 轉(zhuǎn)基因水稻不同株系；M. 分子質(zhì)量標(biāo)記DL2000。ZH11. Zhonghua 11 as negative control; 11，12，13，15，17，19，20. Different lines of transgenic rice. M. Molecular marker DL2000.

2.3.3 篩選OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻在蛋白質(zhì)水平表達(dá)上升的植株 提取5株RNA水平上過(guò)表達(dá)OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻植株的膜蛋白，由于HA與OsPIP2;7為融合蛋白，OsPIP2;7的單克隆抗體較難制備，并且費(fèi)用昂貴，所以用HA抗體檢測(cè)OsPIP2;7-HA的蛋白質(zhì)表達(dá)量。Western-blot結(jié)果顯示，HA標(biāo)簽蛋白在這5株轉(zhuǎn)基因植株中都有表達(dá)(圖6)，說(shuō)明在OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻中，去除水稻中OsPIP2;7的本底表達(dá)，OsPIP2;7在蛋白質(zhì)水平上過(guò)表達(dá)。

ZH11. 陰性對(duì)照植株中花11；1、12、13、19、20. 轉(zhuǎn)基因水稻不同株系；M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記。ZH11. Zhonghua 11 as negative control; 1，12，13，19，20. Different lines of transgenic rice； M. Protein molecular weight Marker.

3 結(jié)論與討論

在水孔蛋白發(fā)現(xiàn)之前，人們一致認(rèn)為水分是通過(guò)自由擴(kuò)散的方式進(jìn)出膜脂雙層的，直至1992年第一個(gè)水孔蛋白的發(fā)現(xiàn)，人們才知道水孔蛋白是水分通過(guò)細(xì)胞膜的最主要方式[8]。水分參與了植物從種子萌發(fā)到衰老死亡的所有過(guò)程，維持體內(nèi)的水分平衡是植物每時(shí)每刻都在進(jìn)行的活動(dòng)，水孔蛋白在其中起到重要的作用[9-13]。在植物的不同物種中克隆到水孔蛋白，并進(jìn)行功能分析后發(fā)現(xiàn)，水孔蛋白除了具有水分選擇性運(yùn)輸功能之外，還可以選擇性的通透尿素[14]、甘油[15]、二氧化碳[16]等小分子和硅[17-18]、硼[6]等營(yíng)養(yǎng)元素。植物的任何生命活動(dòng)都離不開水，維持體內(nèi)的水分平衡對(duì)于植物的生命活動(dòng)至關(guān)重要，因此，水孔蛋白對(duì)于植物在正?；蛘呙{迫生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮了重要的作用。

OsPIP2;7的生物學(xué)功能已有報(bào)道[5-7]，為探索OsPIP2;7的新功能，需要利用OsPIP2;7的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行功能研究。由于水孔蛋白作為膜蛋白本身的特性，主要是低豐度、疏水性等原因，導(dǎo)致水孔蛋白抗體獲得難度大，商業(yè)化的水孔蛋白抗體價(jià)格昂貴，并且水稻中的水孔蛋白家族成員多，與OsPIP2;7同源性較高的蛋白有很多，使用OsPIP2;7作為抗體檢測(cè)不同轉(zhuǎn)基因株系中OsPIP2;7的蛋白質(zhì)表達(dá)量時(shí)，在Western-blot試驗(yàn)時(shí)，難以確定檢測(cè)得到的蛋白量是否為OsPIP2;7的實(shí)際表達(dá)量，因此，很有必要使用標(biāo)簽蛋白系統(tǒng)。目前，市場(chǎng)上應(yīng)用較廣的標(biāo)簽系統(tǒng)包括myc、HA、Flag、His、GST等，其中HA標(biāo)簽系統(tǒng)利用一個(gè)HA(流感病毒血凝素，Influenza hemagglutinin epitope:YPYDVPDYA)短肽融合到目標(biāo)蛋白。HA標(biāo)簽抗體能特異識(shí)別C末端或N末端帶有HA標(biāo)簽的融合蛋白，也可以用于檢測(cè)與HA標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，以及純化、定性或定量檢測(cè)HA標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白等。因此，本試驗(yàn)在植物表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，在OsPIP2;7氨基酸的C末端添加3個(gè)HA標(biāo)簽用于目的蛋白的檢測(cè)，這對(duì)于研究OsPIP2;7的生物學(xué)新功能具有重要的意義。該載體的構(gòu)建解決了使用水孔蛋白抗體檢測(cè)OsPIP2;7的蛋白質(zhì)表達(dá)量試驗(yàn)中，可以檢測(cè)到大量同源蛋白，致使檢測(cè)到的蛋白質(zhì)表達(dá)量不準(zhǔn)確的問(wèn)題。

已有諸多研究表明，水分虧缺、高溫、低溫、鹽脅迫、CO2濃度升高、養(yǎng)分缺乏等非生物逆境脅迫均可改變水孔蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響水分通透活性[19-24]，但通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式將水孔蛋白在植株體內(nèi)高表達(dá)，并進(jìn)行基因功能研究的報(bào)道較少，本研究構(gòu)建pHB-OsPIP2;7-3×HA載體并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)后續(xù)OsPIP2;7新功能的研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。