甜瓜CmDWF1基因的克隆及表達(dá)分析

張 瑾，金烏云，陳瑩瑩，范云飛，郝金鳳，哈斯阿古拉

(內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070)

油菜素內(nèi)酯 (Brassinolide, BL) 被認(rèn)為是第六大植物激素，是植物生長發(fā)育必不可少的生理活性物質(zhì)。油菜素甾醇 (Brassinosteroids, BRs) 是植物中發(fā)現(xiàn)最早的甾醇類激素[1]。BRs對植物的生長發(fā)育具有多種生理功能，如促進(jìn)細(xì)胞伸長與分裂、提高植物的抗逆性、調(diào)控果實發(fā)育等[2-3]。BRs與生長素、赤霉素及乙烯等多種激素都具有協(xié)同作用[4]，共同調(diào)控植物體的生理活動。油菜素內(nèi)酯的合成途徑中，鯊烯 (Squalenne-2,3-oxide) 是合成的起始底物。鯊烯經(jīng)還原反應(yīng)后生成菜油甾醇 (Campesterol,CR)，之后菜油甾醇又經(jīng)過早期的C-22 氧化途徑和2條菜油甾醇依賴途徑 (早期C-6 氧化途徑和后期C-6 氧化途徑)等一系列酶聯(lián)反應(yīng)最終合成BRs[5-6]。

DWF基因家族與BRs的生理活動密切相關(guān)，很多成員都參與了BRs的合成途徑[7-8]，如DWF3(即CPD) 編碼一個C-3脫氫酶，參與早期22-羥化菜油甾醇到22-羥基-4-烯-3-酮等過程[9]；DWF4編碼C-22羥化酶催化BRs合成途徑中多重的C-22 羥基化途徑，維持著BRs內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[10]；DWF6(即DET2) 編碼1個類固醇-5α-還原酶，催化菜油甾醇轉(zhuǎn)化為菜油甾烷醇[11]。DWF家族成員基因發(fā)生突變時，大多會導(dǎo)致植株矮小、育性降低等表型[12-14]。

擬南芥DWF1是DWF基因家族成員，它編碼C-24還原酶，在油菜素內(nèi)酯生物合成中的早期步驟，將24-亞甲基膽固醇轉(zhuǎn)化為菜油甾醇，是油菜素內(nèi)酯合成的重要限速步驟[15]。此外，DWF1基因也受到BRs轉(zhuǎn)錄因子BES1的反饋調(diào)控，進(jìn)而影響內(nèi)源BRs的合成[16]。因此，研究DWF1基因功能有助于系統(tǒng)了解BRs的合成調(diào)控機理以及相應(yīng)功能。擬南芥中，dwf1突變體的植株矮小，生長速度非常緩慢，根系繁多且細(xì)，葉片數(shù)量也較少，總木質(zhì)素和纖維素均比野生型有一定的減少[17]。在玉米中，DWF1基因表達(dá)量下調(diào)同樣會導(dǎo)致植株矮小的表型，維管束分化出現(xiàn)異常,DWF1的功能缺失會導(dǎo)致突變體內(nèi)下游BRs代謝的減少[18-19]。

甜瓜 (CucumismeloL.) 是重要的經(jīng)濟(jì)園藝植物，在全世界各地廣泛種植[20-21]。外源施加油菜素內(nèi)酯可以減緩高溫對甜瓜光合作用的抑制，提高甜瓜幼苗的耐熱性，并且對甜瓜的坐果率以及果實形狀等都有一定的影響，目前油菜素內(nèi)酯已作為植物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于甜瓜的生產(chǎn)上[22-23]，但甜瓜中BRs及其相關(guān)基因作用的具體分子機理還并不清楚。本研究以甜瓜品種河套蜜瓜為研究材料，分析鑒定甜瓜CmDWF1基因并分析其表達(dá)特性，為解釋CmDWF1基因的生理功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料為甜瓜品種河套蜜瓜，原種由內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點實驗室保存?？寺≥d體pEASY?-T1和大腸桿菌 (E.coli)Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。

PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase、dNTP Mixture、DNA Marker、rTap DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 以擬南芥的DWF1(基因序列號為：AT3G19820) 基因序列為探針對甜瓜全基因組數(shù)據(jù)庫MELONOMICS (http://melonomics.net/) 進(jìn)行本地BlastN搜索獲得CmDWF1序列 (ID：MELO3C022613)。使用Primer Premier 5.0設(shè)計目的基因的特異性引物。上游引物序列P1：5′-TT TCCCGGGATGGACCTTGAGGCCTC-3′(SmaⅠ)，下游引物序列P2：5′-GGTACCTTACTCACTTGCCTGCT CTAC-3′(KpnⅠ)。引物由華大基因有限公司合成。

1.2.2 基因克隆CmDWF1基因克隆以甜瓜果實cDNA為模板，PCR程序為：98 ℃ 預(yù)變性5 min；98 ℃ 變性30 s，57 ℃ 退火90 s，68 ℃ 延伸60 s，共30個循環(huán)；68 ℃終延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行切膠回收，連接pMD19-T載體。融合載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定后，挑選陽性菌落送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN軟件對CmDWF1基因序列和測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，并用ORF finder在線工具分析序列的開放閱讀框 (ORF)。使用EXPASY的ProtParam分析CmDWF1蛋白的理化性質(zhì)；通過ProtScale在線軟件分析CmDWF1蛋白的親疏水性氨基酸；通過在線網(wǎng)站CDD 分析Cm-DWF1的保守域；使用SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測Cm-DWF1蛋白質(zhì)的信號肽。使用WOLF PSORT軟件預(yù)測CmDWF1蛋白的亞細(xì)胞定位。通過在線軟件Pole Bioinformatique Lyonnais Network Protein Sequence Analysis預(yù)測CmDWF1蛋白的二級結(jié)構(gòu)。通過SWISS MODEL軟件預(yù)測CmDWF1蛋白的三級結(jié)構(gòu)。采用MEGA 軟件分析CmDWF1與其他物種DWF1之間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 基因表達(dá)特性分析 取甜瓜河套蜜瓜的真葉、莖、根、生長期和呼吸躍變期果實分別提取RNA。以甜瓜甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH) 基因為內(nèi)參基因，使用DNAMAN軟件設(shè)計合成定量PCR特異引物。PCR反應(yīng)體系：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 延伸30 s，共40個循環(huán)，3個技術(shù)重復(fù)。使用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，基因表達(dá)量設(shè)為1，設(shè)置3個獨立生物學(xué)重復(fù)計算標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmDWF1基因克隆和序列分析

提取甜瓜河套蜜瓜果實總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并以此為模板進(jìn)行RT-PCR。擴增得到的CmDWF1基因的特異性產(chǎn)物長度約1 700 bp (圖1)。測序結(jié)果顯示，該片段與甜瓜全基因組數(shù)據(jù)庫MELONOMICS(http://melonomics.net/)中MELO3C022613序列相似度為100%。序列分析表明，甜瓜DWF1基因cDNA序列全長2 282 bp，開放閱讀框 (ORF) 為1 701 bp，起始于393 bp處，終止于2 093 bp處，共編碼566個氨基酸 (圖2)。

2.2 CmDWF1蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

使用Protparam分析CmDWF1編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示CmDWF1蛋白分子式是C3014H4613N787O838S26，其中Glu含量最高 (8.5%)，Cys含量最低 (0.9%)。 CmDWF1蛋白的相對分子量為66.115 11 ku，理論等電點為6.96，不穩(wěn)定指數(shù)為48.18，脂肪系數(shù)為80.94；總平均親水性為-0.402，屬于親水性蛋白。通過ProtScale在線軟件分析，CmDWF1蛋白的親疏水性氨基酸均勻分布。

對CmDWF1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在108-198位氨基酸之間含有FAD-binding-4結(jié)構(gòu)域(圖3)，該位點是FAD結(jié)合位點，推測CmDWF1蛋白可能具有FAD氧化還原酶特性。

M．DL2000 DNA 分子量標(biāo)記; 1.CmDWF1基因的cDNA擴增產(chǎn)物。M．DL2000 DNA Marker;1. Amplification product of CmDWF1 gene.

圖2 CmDWF1基因的全長序列及本其編碼的氨基酸序列Fig.2 Full-length cDNA of CmDWF1 gene and amino acid sequences translated

圖3 CmDWF1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 Predicted conserved domain of CmDWF1 protein

SignalP 4.1 Server在線軟件分析顯示CmDWF1蛋白無信號肽(圖4)。進(jìn)一步使用WOLF PSORT軟件對CmDWF1蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測，該蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位系數(shù)為9 (cyto:9.0)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位系數(shù)為2 (E.R.:2.0)，核定位系數(shù)為1 (nucl:1.0)，質(zhì)膜定位系數(shù)為1 (plas:1.0)。根據(jù)結(jié)果推測CmDWF1蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)，這一結(jié)果與信號肽預(yù)測結(jié)果相吻合。

圖4 CmDWF1蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Predicted signal peptide of CmDWF1 protein

使用Pole Bioinformatique Lyonnais Network Protein Sequence Analysis軟件預(yù)測CmDWF1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋 (Hh) 占37.81%，延伸蛋白占 (Ee) 24.20%，β轉(zhuǎn)角 (Tt) 占8.48%，無規(guī)則卷曲(Cc)占29.51%。SWISS MODEL軟件預(yù)測CmDWF1蛋白的三級結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 CmDWF1蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure prediction of CmDWF1 protein

使用MEGA 5.1軟件將甜瓜 (Cucumismelo) 與黃瓜 (Cucumissativus)、南瓜 (Cucurbitamoschata)、胡楊 (Populuseuphratica)、荷花 (Nelumbonucifera)、黃胡蘿卜 (Daucuscarotasubsp.sativus)、巨桉 (Eucalyptusgrandis)、赤豆 (Vignaangularis)、芝麻 (Sesamumindicum)、花生 (Arachisipaensis)、梅花 (Prunusmume)、蘋果 (Malusdomestica)、葡萄 (Vitisvinifera)、番茄 (LycopersiconesculentumMill.)、柑橘(CitrusreticulataBlanco)等物種的DWF1氨基酸序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖6)，結(jié)果顯示，甜瓜與黃瓜、南瓜親緣關(guān)系較近，與黃胡蘿卜、花生以及葡萄等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 CmDWF1與不同物種DWF1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of CmDWF1 and DWF1 protein in different species

2.3 CmDWF1基因的表達(dá)特性分析

為了了解CmDWF1基因在甜瓜中的表達(dá)特性，使用實時定量PCR檢測甜瓜幼苗的根、莖、葉以及不同發(fā)育時期的果實中該基因的表達(dá)情況。由圖7所示，CmDWF1基因在根、莖、葉中均有一定的表達(dá)，但在根中的表達(dá)量最高。此外，CmDWF1基因在不同時期的果實中的表達(dá)量有明顯的變化：前期表達(dá)量升高，在檢測的樣品中授粉后25 d時表達(dá)量最高，但在35～45 d內(nèi)表現(xiàn)為下降趨勢。表達(dá)特性分析說明，DWF1基因?qū)μ鸸细凸麑嵉冉M織器官的生長發(fā)育可能都具有一定的作用，尤其該基因在果實發(fā)育過程中表達(dá)量的顯著升高，進(jìn)一步說明DWF1基因?qū)μ鸸瞎麑嵉陌l(fā)育可能具有重要調(diào)控功能。

DAP.授粉后天數(shù)。不同字母標(biāo)識的值之間根據(jù)鄧肯多重范圍檢驗具有顯著性差異 (P<0.05)。DAP. Days after pollination. Means marked with the different letters indicate significant difference according to Duncan′s multiple range test (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本研究從甜瓜河套蜜瓜品種中首次克隆得到DWF1基因，cDNA序列全長2 282 bp，與甜瓜基因庫中的預(yù)測序列 (MELO3C022613) 完全一致。通過生物信息學(xué)預(yù)測：CmDWF1基因編碼蛋白為親水性蛋白，具有FAD氧化還原酶特性，并且定位于細(xì)胞質(zhì)中。在已報道的擬南芥、玉米以及豌豆等物種中，DWF1主要都是作為BRs合成過程中的關(guān)鍵還原酶發(fā)揮功能，本研究預(yù)測的甜瓜DWF1的蛋白性質(zhì)與已報道的其他物種中的DWF1蛋白性質(zhì)相吻合，因此推測CmDWF1在甜瓜中也具有相似的功能，其與甜瓜內(nèi)源BRs的合成相關(guān)。

BRs可以促進(jìn)植物細(xì)胞的伸長和分裂，尤其對植物根和葉等組織的生長有很重要的正調(diào)控作用。在擬南芥中，DWF1及其等位基因發(fā)生突變都會產(chǎn)生根和葉發(fā)育異常，植株矮小等典型的BRs缺失突變體相關(guān)表型[24]。因此，DWF1作為BRs合成的還原酶，對植物根、葉等組織的營養(yǎng)生長具有促進(jìn)作用。甜瓜中，CmDWF1基因在根、莖以及葉中均有一定量的表達(dá)，尤其在根中表達(dá)量極高，推測CmDWF1基因可能通過BRs激素來參與甜瓜的根系生長。

此外，BRs同樣也參與肉果類果實發(fā)育成熟的過程。Lisso等[25]發(fā)現(xiàn)BRs處理可以促進(jìn)葡萄成熟，而用BRs合成抑制劑BRZ (Brassinazole) 處理后可以延遲果實成熟過程。番茄的BRs缺失突變體 (dx-fruits) 果實的成熟過程推遲，干質(zhì)量下降，產(chǎn)量減少，氨基酸含量上調(diào)，碳水化合物含量明顯下降，酸轉(zhuǎn)化酶活性降低[26]。而CmDWF1基因在甜瓜授粉后25 d內(nèi)表達(dá)量顯著升高，在45 d時表達(dá)量下降到初始水平。這一結(jié)果預(yù)示著CmDWF1基因可能調(diào)控甜瓜果實發(fā)育過程中內(nèi)源BRs的水平，并最終影響甜瓜果實發(fā)育的生理活動。