森林草莓‘Hawaii 4’繼代培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

韋航濤，馬伯寧，項(xiàng) 晨，劉 佳，楊明峰

(北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

草莓(Fragaria×ananassaDuch)是薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實(shí)香甜可口，是一種深受歡迎的水果[1]。草莓營養(yǎng)價(jià)值豐富，被譽(yù)為“水果皇后”，含有多種維生素、胡蘿卜素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是維生素C含量比蘋果高7～10倍。草莓容易栽培、管理簡(jiǎn)單，但傳統(tǒng)的栽培方式周期長、繁殖慢、易感染病毒[2]。因此優(yōu)化草莓組織培養(yǎng)條件具有十分重要的意義，它既可以快速繁殖出高品質(zhì)草莓苗也避免營養(yǎng)繁殖及連作帶來的病毒積累的問題，同時(shí)也是草莓遺傳轉(zhuǎn)化的前提。優(yōu)化草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系具有很重要的應(yīng)用價(jià)值，可以有目的的改良草莓的品質(zhì)，從而得到常規(guī)育種難以得到的優(yōu)質(zhì)草莓，為草莓的選育栽培及農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)作出貢獻(xiàn)[3]。

草莓的轉(zhuǎn)基因研究始于20世紀(jì)80年代，并且已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)基因草莓株系[4]。目前通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因草莓植株具有抗病蟲害、抗寒、抗旱等優(yōu)良性狀[5]。周鶴瑩[6]以森林草莓‘Hawaii 4’為試驗(yàn)材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到陽性植株，轉(zhuǎn)化效率僅為18%，其組織培養(yǎng)條件和遺傳轉(zhuǎn)化條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化。本研究以‘Hawaii 4’的葉片為試驗(yàn)材料，對(duì)草莓的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了探索，得到草莓苗的組培快繁和高效遺傳轉(zhuǎn)化的條件，為高品質(zhì)草莓品種的選育及其研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：二倍體森林草莓品種‘Hawaii 4’(Fragariavesca，2n=2x=14)。農(nóng)桿菌菌株：EHA105。植物表達(dá)載體：pCAMBIA3301-121(含有植物除草劑草銨膦篩選標(biāo)記)。

1.2 無菌材料的獲得

將草莓種子浸入75%乙醇30 s，無菌水洗3遍，然后浸入2%的NaClO 10 min，再用無菌水洗3遍。然后將種子表面的殘留水分用濾紙吸干并接種于1/2 MS培養(yǎng)基。

1.3 草莓最佳繼代培養(yǎng)基的選擇

為了改良草莓繼代培養(yǎng)的條件，從繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基pH值、含糖量(蔗糖)、瓊脂量進(jìn)行篩選，進(jìn)而對(duì)草莓組織培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。不同條件每組轉(zhuǎn)接7瓶，重復(fù)3組。

1.4 草莓遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1.4.1 草銨膦壓力篩選 pCAMBIA3301-121是帶有抗除草劑Bar基因的植物表達(dá)載體。為保證篩選出陽性抗性植株，將草銨膦濃度設(shè)為1.0、2.0、3.0 mg/L。

1.4.2 草莓葉片脫分化和再分化的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 在不同激素配比的培養(yǎng)基中接種不同葉齡的草莓葉片。用不同濃度的TDZ和6-BA來誘導(dǎo)葉片脫分化，不同濃度IBA和IAA來誘導(dǎo)愈傷組織分化成芽。每周觀察接種后葉片愈傷組織的生長情況及其分化再生情況。30 d后統(tǒng)計(jì)草莓葉片的出愈率和愈傷組織的分化率。

1.4.3 草莓轉(zhuǎn)化條件篩選 將帶有載體pCAMBIA3301-121的農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行劃線活化，并取單菌落在2 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液梯度為OD600=0.4～0.8；取0.8 mL菌液5 000 r/min離心5 min，用20 mL MS懸?。晦r(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)葉片的時(shí)間梯度為10、15、20 min；共培養(yǎng)2 d后用500 mg/mL的Carb進(jìn)行脫菌培養(yǎng)。待愈傷組織分化成芽后，在含有草銨膦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性植株的篩選培養(yǎng)并分析抗性植株的成活率。

2 結(jié)果分析

2.1 草莓‘Hawaii 4’繼代培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 基本培養(yǎng)基對(duì)草莓繼代培養(yǎng)的影響 選用MS和1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，從株高和形成芽數(shù)上看，1/2 MS培養(yǎng)基植株株高相對(duì)較高，形成芽數(shù)相對(duì)較多(表1)。因此1/2 MS更適合森林草莓的繼代培養(yǎng)。

表1 基本培養(yǎng)基濃度對(duì)森林草莓生長的影響Tab.1 Effect of basic medium concentrations on the growth of woodland strawberry

注:不同字母表示差異極顯著(p<0.01)，表2 同

Note：Different letters indicated significant difference(p<0.01),and it is applied to Tab. 2

2.1.2 pH值對(duì)草莓繼代培養(yǎng)的影響 pH值主要影響培養(yǎng)基的硬度，以此來影響草莓的長勢(shì)?；九囵B(yǎng)基在1/2 MS的基礎(chǔ)上選擇的pH值為5.4、5.6、5.8和6.0。pH 5.4和pH 5.6的硬度較差，草莓長勢(shì)一般，pH 5.8效果最好，pH 6.0硬度太強(qiáng)并不利于草莓生長(表2)。

2.1.3 糖含量對(duì)草莓繼代培養(yǎng)的影響 選擇了3種不同含糖量的1/2 MS培養(yǎng)基。由結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基中含10 g/L的糖時(shí)草莓長勢(shì)最高，其次為20 g/L，而30 g/L的長勢(shì)較差(表2)。糖的含量過多不利于草莓的生長。

表2 pH,糖濃度和瓊脂含量對(duì)森林草莓生長的影響Tab.2 Effects of pH,sugar concentrations,and agar on the growth of woodland strawberry

2.1.4 瓊脂量對(duì)草莓繼代培養(yǎng)的影響 選擇了三種不同瓊脂含量的1/2 MS培養(yǎng)基。瓊脂量7 g/L形成芽數(shù)最多，其余含量結(jié)果差異不明顯(p>0.05)；從株高上看，瓊脂量為6 g/L時(shí)植株最高，7 g/L時(shí)次之；但從培養(yǎng)基硬度上看，7 g/L效果最好(表2)。

2.2 草莓的草銨膦壓力篩選

草銨膦為1 mg/L處理莖端，生長趨勢(shì)受到抑制，葉片泛黃；2 mg/L時(shí)，30 d左右莖端枯萎死亡；3 mg/L時(shí)14 d莖端死亡(圖1)。草銨膦2 mg/L為最佳篩選濃度，是達(dá)到足夠篩選壓力的合適濃度。

2.3 草莓葉片脫分化和再分化的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

將剛展開的葉片進(jìn)行脫分化和再分化培養(yǎng)，脫分化成愈傷組織的培養(yǎng)基激素配比為3.0 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的IBA。愈傷組織再分化成芽的培養(yǎng)基激素配比為3.0 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的IBA(表3)。

A.1 mg/L；B.2 mg/L；C.3 mg/L圖1 不同濃度草銨膦對(duì)森林草莓生長的影響Fig.1 Different concentrations of herbicide on the growth of woodland strawberry ‘Hawaii 4’

表3 不同激素配比對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響Tab.3 Effects of hormone compositions on callus formation

2.4 草莓轉(zhuǎn)化條件篩選

通過農(nóng)桿菌侵染葉片(圖2-A)，脫分化成愈傷組織(圖2-B)，愈傷組織分化成芽(圖2-C)，在含有草銨膦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性植株的篩選培養(yǎng)得到抗性苗(圖2-D)，最后分析抗性植株的成活率。共侵染40片草莓葉片，脫分化得到38個(gè)愈傷組織，分化得到再生芽38株，經(jīng)過草銨膦抗性壓篩選得到陽性植株35株，轉(zhuǎn)化率為87%。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果為：理想的農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.6侵染15 min；培養(yǎng)基添加500 mg/L的Carb進(jìn)行脫菌培養(yǎng)。

A.葉片誘導(dǎo)愈傷組織；B.愈傷組織；C.愈傷組織分化；D.生根培養(yǎng)圖2 森林草莓遺傳轉(zhuǎn)化過程A.Leaf-induced callus; B.Callus; C.Callus differentiation; D.Rooting cultureFig.2 Genetic transformation process of woodland strawberry ‘Hawaii 4’

3 討 論

優(yōu)化草莓組織培養(yǎng)條件和建立高效穩(wěn)定的草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系是快速繁殖草莓苗、培育高品質(zhì)草莓品種的關(guān)鍵。二倍體草莓基因組小、生長周期短、易于栽培、容易再生且與高倍體食用草莓親緣關(guān)系近，本試驗(yàn)以二倍體草莓‘Hawaii 4’為材料優(yōu)化了森林草莓的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化條件。

草莓的遺傳轉(zhuǎn)化效率受許多條件的影響[7]，其中包括內(nèi)部基因調(diào)控和植物外界環(huán)境的影響。不同激素種類與配比影響也較大[8]。生長素促進(jìn)植物根的生長，細(xì)胞分裂素則促成莖的生成，兩者的不同濃度配比可以誘導(dǎo)芽的生成。Nehra[9]用6-BA和IBA誘導(dǎo)‘Redcoat’草莓葉片再生成芽，得到了6.5%的轉(zhuǎn)化率。馮利[10]用0.5 mg/L 6-BA 對(duì)‘紅頰’草莓進(jìn)行初代和繼代培養(yǎng)，用1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA進(jìn)行芽的誘導(dǎo),不定芽再生率為77.8%。喬瑞琪等[11]以‘Ruegen’草莓葉片為試驗(yàn)材料，選用2.0 mg/L的TDZ和0.2 mg/L的IBA，使草莓的不定芽再生率達(dá)到81.03%。TDZ是具有細(xì)胞生長素和細(xì)胞分裂素分裂雙功能的激素，它能夠使難以分化的植物分化[12]，但TDZ濃度過高會(huì)抑制愈傷組織分化并加快葉片死亡[13]。而6-BA則有利于愈傷組織分化且濃度過高不會(huì)導(dǎo)致葉片死亡。本研究在激素濃度配比方面選用6-BA和IBA兩種植物生長調(diào)節(jié)劑，在1/2 MS培養(yǎng)基上添加3.0 mg/L 的6-BA和0.2 mg/L IBA進(jìn)行誘導(dǎo)再生培養(yǎng)，草莓‘Hawaii 4’的不定芽再生率達(dá)到87.0%。高于其他草莓品種的不定芽再生率。

草莓轉(zhuǎn)基因研究的方法主要有電轉(zhuǎn)化法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等[14]，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中，侵染菌液的OD值、侵染時(shí)間是決定轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素[15]。張紅梅和王俊麗[16]使用農(nóng)桿菌對(duì)‘全明星’草莓葉片的進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究，認(rèn)為菌液濃度OD600=0.5，侵染時(shí)間5～15 min都可取得比較理想的轉(zhuǎn)化效果。森林草莓‘Hawaii 4’理想的菌液濃度和侵染時(shí)間與‘全明星’草莓相似，理想的菌液濃度和侵染時(shí)間顯著提高了草莓的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

本研究綜合比較各種不同的試驗(yàn)處理，成功優(yōu)化了森林草莓‘Hawaii 4’組織培養(yǎng)條件和遺傳轉(zhuǎn)化條件，加快了草莓苗擴(kuò)繁速度，也為草莓基因工程研究提供了重要參考。