姜黃素通過調(diào)控Tiam1蛋白表達(dá)影響鼻咽癌增殖與侵襲的研究

陳 娟1，賀秋冬1，艾小紅2

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001 )

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是頭頸部常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高達(dá)20/105～50/105，人群分布上呈現(xiàn)顯著種族差異性，好發(fā)于黃種人，而歐美發(fā)病率則較低。且以男性居多，男女發(fā)病率之比為2∶1～3∶1，40～60歲為發(fā)病高峰[1-3]。2018年中國新增鼻咽癌患者達(dá)60 000例左右，患者確診時多為中晚期，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床上鼻咽癌治療效果欠佳或死亡的主要原因[4]。因此，探究鼻咽癌增殖及侵襲相關(guān)標(biāo)志物對鼻咽癌的早期診斷、治療及預(yù)后具有重要的臨床意義。近期研究證實(shí)：Tiam1(T-cell lymphoma invasion and metastasis-inducing factor1)高表達(dá)與胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[5-6]，但Tiam1在鼻咽癌增殖及侵襲主要作用機(jī)制目前仍不清楚。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗血管生成、抗腫瘤等多種功效。最近研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過誘導(dǎo)非編碼長鏈RNA表達(dá)，增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對放射性治療的敏感性，為鼻咽癌治療中應(yīng)用姜黃素提供了依據(jù)[7]。本課題通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測鼻咽癌組織中Tiam1的表達(dá)情況，分析鼻咽癌組織及鼻咽黏膜慢性炎癥組織中Tiam1表達(dá)情況；以鼻咽癌5-8F細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，采用不同濃度的姜黃素處理鼻咽癌細(xì)胞，探討姜黃素抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖及侵襲的機(jī)制。為姜黃素治療鼻咽癌尋找新的作用靶點(diǎn)，為姜黃素作用于鼻咽癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)收集從2010年1月至2013年1月期間南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科保存的鼻咽癌石蠟標(biāo)本共57例，鼻咽黏膜慢性炎癥石蠟標(biāo)本10例，并收集完整臨床及病理資料，所有入選鼻咽癌病例活檢前均未接受化療或放療(即初診患者)，活檢后均被病理確診為鼻咽癌病例。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用5-8F鼻咽癌細(xì)胞，由南華大學(xué)腫瘤研究所張志偉老師課題組饋贈。

1.2 免疫組化

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科收集石蠟組織切片后，保存于4 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)脫蠟前，應(yīng)將鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎性組織切片置于在65 ℃溫箱中烘烤30 min，吹風(fēng)機(jī)吹3 min；然后進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷、封閉、一抗孵育、復(fù)染、脫水、封片。姜黃素(上海麗臣商貿(mào)有限公司)；Tiam1抗體(美國Santa Cruz公司)、鼠抗人β-actin抗體(美國Abgent公司)孵育并洗滌后采用DAB顯色，采用蘇木精復(fù)染切片，用1%鹽酸酒精分化、自來水沖洗、封片，最后送鏡檢。

1.3 結(jié)果判讀采用雙盲式閱片

組織封片待中性樹膠干燥可永久保存后，用倒置光學(xué)顯微鏡觀察，并進(jìn)行拍照，每張切片先低倍鏡(100倍)下初步觀察，再于高倍鏡下(400倍)隨機(jī)選取5個視野，編號保存圖片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：Tiam1蛋白主要陽性表達(dá)于細(xì)胞漿，為淺黃至棕褐色顆粒，分布均勻，根據(jù)細(xì)胞的染色程度及陽性率進(jìn)行判斷。染色程度評分標(biāo)準(zhǔn)為：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細(xì)胞染色率評分標(biāo)準(zhǔn)為：陰性記為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。判斷標(biāo)準(zhǔn)目前多采用積分法，公式如下：染色程度×陽性細(xì)胞率。標(biāo)準(zhǔn)參考0～2分為陰性，≥3者為陽性，每張切片至少隨機(jī)選取5個視野，每視野隨機(jī)選取100個細(xì)胞評價，取最后均值。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代及凍存

操作前準(zhǔn)備：將已配好的新鮮培養(yǎng)基、PBS液、胰蛋白酶瓶放入37 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱，備用。用75%酒精擦拭超凈工作臺臺面，臺面放置移液器、TIP頭、酒精燈、打火機(jī)、污物盒紫外線照射30 min后，用75%酒精擦拭雙手，正確擺放使用器械，點(diǎn)燃酒精燈。5-8F細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞換液、傳代、凍存，備用。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力

按細(xì)胞培養(yǎng)方法將對數(shù)生長期細(xì)胞制成2×104/mL單細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)設(shè)置溶劑對照組、空白對照組及5個濃度組，每組設(shè)置5個重復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后細(xì)胞基本貼壁，加入不同濃度的姜黃素(10～160 μmol/L)各100 μL，溶媒對照組加入0.1%DMSO100 μL，空白組加入100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后傾去上清；用酶標(biāo)儀測定波長為450 nm條件下的細(xì)胞的吸光度。

劃痕實(shí)驗(yàn):依照CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以姜黃素處理24 h后細(xì)胞活力值繪制生長曲線所得藥物IC50為參考，選出3個實(shí)驗(yàn)濃度組，分別為20、60、100 μmol/L的姜黃素實(shí)驗(yàn)組；細(xì)胞培養(yǎng)方法將對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以106個細(xì)胞/孔接種于6孔板，以滅菌10 μL Tip頭在6孔板中心劃一條直線，24 h后觀察劃痕處細(xì)胞遷移情況并拍照。

侵襲實(shí)驗(yàn):取Matrigel膠與1640培養(yǎng)基，按1∶4混合均勻(冰上操作)，鋪膠(避免氣泡)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培育箱中凝膠直至出現(xiàn)白色固態(tài)層；不同濃度姜黃素組及空白對照組分別加入對應(yīng)細(xì)胞懸液200 μL/孔；置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培育箱中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察并隨機(jī)選擇3個視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，拍照。

Western blot檢測:提取不同濃度藥物處理組及空白組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、PVDF膜的封閉、抗體的孵育、顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Tiam1蛋白在鼻咽組織中表達(dá)

如圖1、圖2所示，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)法檢測57例不同病理類型的鼻咽癌組織及10例鼻咽黏膜慢性炎癥組織中Tiam1表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tiam1在慢性鼻咽炎組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在鼻咽癌中陽性表達(dá)率明顯高于其在慢性鼻咽炎組織中表達(dá)率(P<0.05)。

圖1 Tiam1蛋白在不同類型鼻咽組織的表達(dá)(SP，400×)A：鼻咽黏膜慢性炎癥組織;B：鼻咽癌組織

圖2 鼻咽組織中Tiam1陽性表達(dá)率與鼻咽黏膜慢性炎癥組比較，*P<0.05

2.2 姜黃素對鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖被藥物明顯抑制，而未處理的鼻咽癌5-8F細(xì)胞體外生長情況良好，空白對照組與DMSO組增殖情況無差異(P>0.05)。圖3顯示24、48、72 h三個時間段，實(shí)驗(yàn)組5-8F細(xì)胞增殖隨著姜黃素濃度改變而受到不同程度的抑制。相同姜黃素濃度處理下，因作用時間延長5-8F細(xì)胞增殖活力值下降；各組細(xì)胞處理時間一致的情況下，隨著姜黃素濃度增加，細(xì)胞增殖抑制越顯著。結(jié)果表明，姜黃素處理后細(xì)胞增殖能力降低，5-8F細(xì)胞增殖與姜黃素作用存在濃度和時間依賴性(P<0.05)。由于5-8F細(xì)胞周期約24 h，為排除細(xì)胞自然增殖對實(shí)驗(yàn)的影響，選取藥物處理24 h的IC50值(56 μmol/L)作為調(diào)整實(shí)驗(yàn)組濃度的依據(jù)，設(shè)置三個藥物處理組(20、60、100 μmol/L)和空白對照組繼續(xù)Transwell及Western blot實(shí)驗(yàn)。

圖3 姜黃素對5-8F細(xì)胞增殖活力的影響(24h、48h、72h)與對照組比較，*P<0.05

2.3 姜黃素對鼻咽癌5-8F細(xì)胞遷移的影響

圖4、圖5所示為不同濃度姜黃素處理5-8F細(xì)胞24 h后細(xì)胞遷移變化，0 h時各組細(xì)胞劃痕距離一致，處理24 h后，空白組劃痕距離較實(shí)驗(yàn)組明顯縮小，且隨著姜黃素濃度增加，其遷移的距離越短(P<0.05)。

2.4 姜黃素對鼻咽癌5-8F細(xì)胞侵襲能力的影響

圖6、圖7所示為不同濃度姜黃素處理5-8F細(xì)胞24 h后對細(xì)胞侵襲能力的影響，0 h時各組下層小室均未見穿膜細(xì)胞。處理24 h后，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)較空白組明顯減少，且隨著姜黃素濃度增加，其穿膜細(xì)胞數(shù)越少(P<0.05)。

圖4 0h和24h各組細(xì)胞遷移情況(10×)

圖5 姜黃素對鼻咽癌5-8F細(xì)胞遷移的影響與對照組比較，*P<0.05

2.5姜黃素對鼻咽癌5-8F細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)的影響

圖8、圖9所示為不同濃度姜黃素處理5-8F細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)Tiam1蛋白變化情況?？瞻捉MTiam1蛋白表達(dá)含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組間：100 μmol/L組Tiam1蛋白表達(dá)量低于60 μmol/L、20 μmol/L組，20 μmol/L蛋白表達(dá)量最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。姜黃素能下調(diào)5-8F細(xì)胞中Tiam1蛋白表達(dá)，從而抑制5-8F細(xì)胞。

圖6 不同濃度姜黃素對5-8F細(xì)胞侵襲能力影響(SP，200×)A:空白對照組;B:20 μmol/L組;C:60 μmol/L組;D:100 μmol/L組

圖7 不同濃度姜黃素對5-8F細(xì)胞侵襲能力影響與對照組比較，*P<0.05

圖8 姜黃素對5-8F細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)的影響

圖9 姜黃素對各組細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，*P<0.05

3 討 論

近年來，全球癌癥發(fā)病率和死亡率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年我國將新增腫瘤患者約429.2萬，因惡性腫瘤導(dǎo)致死亡病例約281.4萬[1]。鼻咽癌是我國“兩廣”地區(qū)常見惡性腫瘤之一，EB病毒感染，環(huán)境因素和遺傳易感性是鼻咽癌的主要病因。大部分鼻咽癌屬于放療敏感性惡性腫瘤，隨著放化療技術(shù)的不斷發(fā)展，局限期鼻咽癌患者收獲了較好的治療效果，但伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例放化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，5年生存率僅為50%～60%[9]。目前鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全明確，深入了解與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，對鼻咽癌的治療及預(yù)后具有深遠(yuǎn)意義。

Tiam1是一個與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，可特異性激活Rho蛋白家族GTPase活性，其下游效應(yīng)因子主要為Rho蛋白家族重要成員Rac1，參與Rac1介導(dǎo)的信號通路調(diào)控發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞骨架的活動，細(xì)胞內(nèi)吞作用和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞遷移、粘附、侵襲、凋亡和腫瘤生成[10]。Tiam1在肝細(xì)胞癌[11]、食管癌[12]、直腸癌[13]、宮頸磷癌[14]均高表達(dá)，且與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在鼻咽癌中，Tiam1蛋白高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tiam1在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中低表達(dá)或不表達(dá)，Tiam1在鼻咽癌中表達(dá)明顯高于鼻咽黏膜慢性炎癥組織。接著本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)中成藥姜黃素姜抑制鼻咽癌增殖及侵襲可能與Tiam1蛋白表達(dá)降低相關(guān)。

姜黃素抗腫瘤作用主要是通過與多種生物效應(yīng)蛋白作用，通過這些蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、受體、細(xì)胞因子和酶，抑制細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)凋亡。姜黃素與放化療結(jié)合可增加治療敏感性、減輕毒副反應(yīng)、甚至可逆轉(zhuǎn)腫瘤天然耐藥性[7]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用姜黃素體外處理5-8F細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著姜黃素濃度增加和作用時間延長，5-8F細(xì)胞增殖活力明顯下降，增殖抑制呈濃度-時間依耐性，與Pan Y研究結(jié)果[15]相符合，說明姜黃素可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖活力。姜黃素是否能抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)姜黃素抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力。本研究證實(shí)一定濃度姜黃素處理5-8F細(xì)胞后其侵襲能力明顯減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Wong TS[16]研究結(jié)果相似，說明姜黃素可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲。通過體外細(xì)胞模擬侵襲轉(zhuǎn)移過程的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)姜黃素對鼻咽癌細(xì)胞具有一定的抗侵襲作用，但是其具體通過何種分子機(jī)制作用仍需進(jìn)一步探究可能存在的分子靶點(diǎn)。姜黃素處理后的5-8F細(xì)胞增殖及遷移能力均下降，其可能通過作用于多種蛋白發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫印跡法檢測姜黃素處理后5-8F細(xì)胞Tiam1表達(dá)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯下降，說明姜黃素可能通過抑制Tiam1表達(dá)而降低鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲。

本課題初步探討鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的可能靶點(diǎn)及機(jī)制，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tiam1在鼻咽癌組織中高表達(dá)，而姜黃素是一種具有潛在抗腫瘤轉(zhuǎn)移的中草藥，通過Western blot實(shí)驗(yàn)了解不同濃度姜黃素處理的鼻咽癌細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著姜黃素濃度增加，鼻咽癌5-8F細(xì)胞中Tiam1的表達(dá)量下降，細(xì)胞的遷移侵襲被抑制，進(jìn)一步提示姜黃素可能通過抑制侵襲相關(guān)基因Tiam1的表達(dá)而抑制鼻咽癌的侵襲。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步揭示鼻咽癌的轉(zhuǎn)移可能存在的靶點(diǎn)及姜黃素在鼻咽癌中的藥理作用，為鼻咽癌的分期分級和治療提供一定的理論依據(jù)。