X射線熒光光譜法在藥品元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

徐昕怡，劉 貞，洪小栩

1 國家藥典委員會(huì)，北京 100061；2 江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，南昌 330029

自2010年國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）發(fā)布了Q3D 元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則以來，美國、歐盟進(jìn)一步限制了藥品中的元素雜質(zhì)水平[1，2]，藥品中元素雜質(zhì)的控制越來越受到關(guān)注。X 射線熒光光譜（X-ray fluorescence spectrometry，XRF）是基于測量由初級(jí)X 射線激發(fā)的原子內(nèi)層殼電子產(chǎn)生的特征X 射線光量子的一種儀器分析方法?？捎糜诜治鰷y定液體、粉末和固體材料樣品中不同元素產(chǎn)生的熒光X 射線波長（或能量）和強(qiáng)度，獲得元素組成與含量信息，達(dá)到定性和定量分析的目的，目前已在地質(zhì)、冶金、材料、環(huán)境、工業(yè)等的無機(jī)分析領(lǐng)域得到了極其廣泛的應(yīng)用[3]。盡管近年來XRF 在中藥元素成分分析以及鑒定評(píng)價(jià)方面已有不少報(bào)道[4-6]，但在其他藥物分析領(lǐng)域中的研究較少。本文綜述了近年來國內(nèi)外XRF 在藥品元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用情況，旨在為藥品中元素雜質(zhì)控制研究提供參考。

1 XRF 的分類和特點(diǎn)

XRF 具有分析速度快、檢測元素范圍廣、前處理簡便、無污染、成本低廉以及無損檢測等優(yōu)點(diǎn)[7]，可用于各類樣品中主、次、痕量多元素同時(shí)測定。根據(jù)分光方式不同，XRF 可分為波長色散型（WDXRF）和能量色散型（EDXRF）。WDXRF 具有較高的分辨率，體積大，需要較強(qiáng)的光源和專用的晶體光學(xué)元件，因此僅限于實(shí)驗(yàn)室中使用。實(shí)驗(yàn)室級(jí)EDXRF 自20世紀(jì)60年代早期開始使用，隨著硬件和軟件的不斷發(fā)展，手持式及便攜式EDXRF 的研發(fā)在近三十年中逐漸深入，其性能接近于實(shí)驗(yàn)室用EDXRF。根據(jù)X 射線出射、入射角度還可分全反射X 射線熒光光譜（TXRF）、掠出射X 射線熒光光譜（GEXRF）和掠入射X 射線熒光光譜（GI-XRF）等[8]。目前同時(shí)配備XRF 和ICP-MS 是國外分析實(shí)驗(yàn)室的趨勢，利用XRF 分析含量較高的元素，用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析低濃度的元素[8]。XRF 和ICP-MS 在主要性能上的優(yōu)點(diǎn)和局限性見表1 所示[9]。

表1 XRF 和ICP-MS 在主要性能上的比較[9]

2 各國藥典中的XRF 標(biāo)準(zhǔn)

目前2015年版《中國藥典》暫未收載XRF 技術(shù)，但《美國藥典》（USP）41 版通則 〈735〉、歐洲藥典（EP）9.0 版通則2.2.37 和《英國藥典》BP 2019 版附錄ⅡK 均收載了XRF[10-12]。USP 介紹了XRF 的定義、原理、儀器性能、測定方法、確認(rèn)和驗(yàn)證等內(nèi)容。EP 介紹了XRF 的定義、原理、測定方法、校正方法及計(jì)算公式。BP 介紹了XRF 的原理、儀器、基質(zhì)效應(yīng)和干擾、樣品制備、測定方法、儀器性能控制和驗(yàn)證要求[12]。BP 還指出，XRF 作為質(zhì)量控制或過程控制方法，廣泛用于篩選原料藥和制劑中的元素雜質(zhì)。由于XRF 的非破壞性，適用于過程分析技術(shù)（PAT），如分析原料藥中殘留的痕量催化劑[12]。

3 XRF 在藥品元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

3.1 在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

制藥企業(yè)通常將新藥研究重點(diǎn)聚焦于未滿足的醫(yī)療需求上，新藥的研發(fā)速度往往由患者驅(qū)動(dòng)。因此，在藥物研發(fā)過程中快速做出決策，可更快地提高患者的治愈率，元素雜質(zhì)分析是可提高研發(fā)效率的一個(gè)步驟。金屬催化劑通常用于原料藥的合成中，研發(fā)者需要監(jiān)測各種原料和合成工藝中金屬催化劑的殘留情況，從而實(shí)施有效的控制策略。通常使用靈敏度、精密度高和選擇性好的電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES 或ICP-OES）或ICP-MS，對藥物中的元素雜質(zhì)進(jìn)行分析[13-15]。然而，在藥物研發(fā)期間，許多樣品不需要這些昂貴、費(fèi)時(shí)、靈敏度高的技術(shù)。研發(fā)者通常需要快速確定元素含量，以提高優(yōu)化合成工藝的效率。XRF 可更快速、更簡便地測定原料、中間體和研發(fā)樣品中的元素雜質(zhì)含量，同時(shí)保證必要的準(zhǔn)確度。然而，傳統(tǒng)的XRF 分析需要大量樣品，不適用于藥物研發(fā)的早期階段。手持式XRF 具有幾個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，可作為篩查金屬催化劑去除有效性的現(xiàn)場分析工具：一是成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室儀器；二是可以在實(shí)驗(yàn)室間移動(dòng)使用；三是具有足夠的靈敏度；四是特別適用于專業(yè)能力不高的分析工作者。開發(fā)一種手持式XRF 儀器的方法通常需時(shí)不到30 分鐘，使用者可以在短時(shí)間內(nèi)接受操作培訓(xùn)[16]。Lewen N 等[16]使用手持式XRF 確立篩查金屬催化劑去除工藝的有效性，通過對不對稱Suzuki 偶聯(lián)反應(yīng)、Buchwald-Hartwig 交叉偶聯(lián)反應(yīng)中去除鈀以及Ullmann-Goldberg 偶聯(lián)反應(yīng)中去除銅的研究，成功測定了近900 個(gè)固體和液體研發(fā)樣品中的鈀和銅含量。研究表明，手持式XRF 可替代傳統(tǒng)的ICP-OES 測定鈀和銅含量，快速確定金屬催化劑去除工藝的有效性，可為原子光譜和工藝化學(xué)部門節(jié)省近兩個(gè)月的全職人力工時(shí)（FTE），同時(shí)節(jié)省溶劑、氬氣和耗材的費(fèi)用[16]。

3.2 在原料藥元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

作為提高藥物安全性和有效性的一部分，制藥企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對原料藥（API）的雜質(zhì)控制十分重視。元素雜質(zhì)可以從各種來源（如原料、試劑、溶劑、催化劑、反應(yīng)容器、管道和其他用于合成藥物的設(shè)備）引入原料藥中。由于某些元素具有潛在的毒性，美國FDA“指南”指出，在制藥生產(chǎn)中控制殘留元素含量至關(guān)重 要[17]。Marguí E 等[18]利用WDXRF 測定原料藥中的金屬雜質(zhì)鐵、鋅、鉻、鎳，方法的檢測限和定量限滿足歐洲藥品評(píng)價(jià)局（EMA）和ICH Q2（R1）的要求，適用于原料藥目標(biāo)無機(jī)雜質(zhì)的定性和定量檢測。與藥典的重金屬目視比色檢測方法不同，該技術(shù)可以輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，是快速常規(guī)分析的理想工具[18]。催化在醫(yī)藥化學(xué)工業(yè)中具有重要的作用，它可以減少碳-碳和碳雜原子鍵形成過程中的活化能，從而提高結(jié)構(gòu)改造的效率，降低總成本和時(shí)間。鈀通常被認(rèn)為是原料藥形成碳-碳和碳雜原子鍵應(yīng)用最廣泛的金屬，在醫(yī)藥工業(yè)中廣泛用于催化反應(yīng)[19，20]，但必須將其除去后方可成為藥用原料。Marguí E 等[20]通過高能偏振束能量色散X 射線熒光（HE-P-EDXRF），建立了一種簡單、快速、可靠的分析方法，可測定三唑類抗真菌原料藥中催化劑靶的殘留量。

EDXRF 類型中的TXRF，比傳統(tǒng)EDXRF 的背景信號(hào)更低且檢測限低3 個(gè)數(shù)量級(jí)[9]，還具有動(dòng)態(tài)范圍寬（至少4 個(gè)數(shù)量級(jí)）、所需樣品量?。é蘥）、定量簡單、基質(zhì)效應(yīng)可忽略等優(yōu)點(diǎn)，可通過內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)對原子序數(shù)在14～92 內(nèi)的多元素快速定量測定，是一種快速的元素篩選分析技術(shù)[8，21，22]。Wagner M 等[21]利用TXRF 研究了不同來源的胰島素、普魯卡因和色氨酸樣品中的微量元素的含量比例，得到了元素指紋圖譜相關(guān)信息，能夠區(qū)分不同生產(chǎn)純化工藝的不同批次的樣品。Lásztity A等[22]利用TXRF 篩查發(fā)現(xiàn)，左旋多巴中金屬含量低于5 μg·g-1，亞葉酸鈣中鐵、鋅、鍶的含量為44、10、6 μg·g-1，馬來酸依那普利中鐵的含量為17 μg·g-1。Antosz FJ 等[23]利用TXRF 對原料藥樣品中的鈀和銅進(jìn)行了定量分析，測定結(jié)果在檢測限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度方面與ICP-MS 相當(dāng)。

3.3 在藥用輔料元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

2015 版《中國藥典》采用原子吸收光譜法（AAS）測定明膠空心膠囊中的有毒重金屬鉻的殘留，該法需要復(fù)雜的前處理過程，時(shí)間消耗較長。李俊卿、尹利輝等[24，25]建立了手持式EDXRF 快速檢測明膠空心膠囊中鉻的含量。方法的檢測限為10 mg·kg-1，與AAS 測試結(jié)果比較，Cr 含量大于10 mg·kg-1的陽性樣品的檢測率為100%。該方法可以無損傷直接測試樣品，一次同時(shí)分析多種元素，便于現(xiàn)場分析，分析時(shí)間短，4分鐘即可篩查出一個(gè)樣品，大大提高了分析效率。

3.4 在制劑元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用

對患者而言，藥物制劑的安全性和有效性更為重要。因此，重點(diǎn)研究XRF 在制劑元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用，比工藝研發(fā)時(shí)分析個(gè)別原料藥的元素雜質(zhì)殘留量更有意義[26]。Goncalves LML 等[26]利用WDXRF 對兩種原研藥和仿制藥中的金屬元素雜質(zhì)含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，WDXRF 在一定范圍內(nèi)具有可接受的線性、精密度和準(zhǔn)確度，適用于藥物制劑中銅、鋅、鐵、鉻雜質(zhì)的測定，是藥典中重金屬目視比色檢測法的良好替代方法。

由于制樣簡單、設(shè)備和分析成本較低，以及可現(xiàn)場對大量產(chǎn)品進(jìn)行快速篩查，XRF 已被美國FDA 用于各種監(jiān)管用途[9]。

圖1 美國FDA 現(xiàn)場作業(yè)中使用ICP-MS 和XRF 測定制劑中有毒元素的步驟[9]

圖1 描述了美國FDA 使用ICP-MS 方法與XRF 方法進(jìn)行制劑元素分析時(shí)所涉及的各個(gè)步驟。圖左ICP-MS 方法的最大瓶頸是樣品制備過程，為得到適合分析的提取物，需要費(fèi)時(shí)耗力的固體樣品消化和過濾步驟。相比而言，圖右中用于初篩的XRF 方法，僅需要簡單的樣品制備步驟（即直接按樣品原樣等份倒入XRF 分析杯中進(jìn)行分析）。若初篩結(jié)果顯示特定元素未檢出，則可將樣品研磨為更均勻的粉末，以提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。通過手持式XRF 實(shí)現(xiàn)對樣品的高通量快速篩選，在遇到可能的違規(guī)樣本時(shí)，即當(dāng)元素濃度超過限量及（或）處于急性或長期毒性水平時(shí)（如10 ppm），采用定量XRF 方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。若低于規(guī)定限值，利用ICP-MS 等實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行定量分析獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。此步驟節(jié)省了大量時(shí)間和成本，能夠在相同時(shí)間內(nèi)篩選更多產(chǎn)品中是否存在有毒元素[9]。Arzhantsev S 等[27]使用連續(xù)波變換濾除光譜信號(hào)和噪聲成分的手持式XRF 光譜儀，篩查了27 種膠囊、片劑和膏劑藥物，發(fā)現(xiàn)14 種藥品含有重金屬，并利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）證實(shí)了XRF 的篩選結(jié)果，XRF 測定值的誤差在預(yù)期范圍內(nèi)。

4 小 結(jié)

XRF 具有分析快捷、直觀、可靠等優(yōu)勢，可作為AAS、ICP-AES 和ICP-MS 的替代技術(shù)，可定量分析原藥、輔料和制劑中的殘留元素。XRF 在藥物研發(fā)、原藥和制劑的金屬催化劑殘留及藥物有毒元素的快速篩查等方面的研究不斷深入，應(yīng)用不斷擴(kuò)大。除用于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分析外，XRF 還是一種為數(shù)不多的可手持、便攜式的元素分析技術(shù)，很適合大批量樣品的快速、現(xiàn)場或在線檢測。此外，XRF 與化學(xué)計(jì)量學(xué)、色譜和光譜技術(shù)應(yīng)用于過程控制，提供有毒元素的信息并篩查出成分復(fù)雜的假藥，這將是未來的發(fā)展方向。目前，USP、EP 和BP 均已收載XRF 作為法定的方法，在國際合作與交流日益加強(qiáng)的今天，建議將XRF 收載入《中國藥典》，建立相應(yīng)的方法標(biāo)準(zhǔn)，有利于規(guī)范和指導(dǎo)XRF 在藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用，為藥品中元素雜質(zhì)的檢測增加一種質(zhì)量控制方法。