提高乳康舒膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

任會(huì)旭，吳嫣艷，胡浩彬

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；2 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019

乳康舒膠囊由鹿角、淫羊藿、白芍、郁金、王不留行、丹參6 味藥材組成。具有益腎疏肝、止痛散結(jié)等作用，用于乳腺增生病證屬腎虛肝郁、沖任失調(diào)者。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（YBZ00592009），其僅有淫羊藿苷、芍藥苷、原兒茶醛的薄層色譜鑒別和淫羊藿苷、芍藥苷的含量測(cè)定。為提高乳康舒膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文擬建立淫羊藿、王不留行的薄層色譜鑒別法，以及乳康舒膠囊中淫羊藿苷、王不留行黃酮苷、芍藥苷3 個(gè)成分的高效液相色譜法，為該制劑的質(zhì)量控制提供參考[1-5]。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

LC-20AB HPLC（日本島津）；CPA224S 型，BS21S 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；MX5 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 藥品與試劑

乳康舒膠囊（批 號(hào)16100791、171116ML、171118MM，江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司）；淫羊藿苷對(duì)照品（純度94.2%，批號(hào)110737-201516）、王不留行黃酮苷對(duì)照品（純度92.6%，批號(hào)111853-201303）、芍藥苷對(duì)照品（純度95.7%，批號(hào)110736-201741）、淫羊藿對(duì)照藥材（批號(hào)121632-201101）、王不留行對(duì)照藥材（批號(hào)121094-201305），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；陰性對(duì)照制劑為實(shí)驗(yàn)室自制。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司），其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 淫羊藿

供試品溶液制備：取本品內(nèi)容物2 g，置錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，固體物加甲醇2 mL 使溶解，即得。

對(duì)照藥材溶液制備：取淫羊藿對(duì)照藥材0.5 g，余同“供試品溶液制備”。

對(duì)照品溶液制備：取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含0.4 mg 的溶液，即得。

陰性對(duì)照溶液制備：取缺淫羊藿的陰性樣品，余同“供試品溶液”制備方法。

薄層色譜鑒別方法：吸取供試品、對(duì)照藥材、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液各2～5μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲醇-丁酮-三氯甲烷-水（4∶6∶6∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。于供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的綠色熒光斑點(diǎn)，陰性制劑無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.1.2 王不留行

供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液制備：同“2.1.1”。

圖1 淫羊藿TLC 色譜圖

鑒別方法：除展開(kāi)劑為正丁醇-乙酸乙酯-水-甲酸（4∶1∶5∶0.5）的上層溶液，5%三氯化鋁乙醇顯色外，余同淫羊藿鑒別方法。結(jié)果可見(jiàn)供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 王不留行TLC 色譜圖

2.2 乳康舒HPLC 法測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）（梯度洗脫：0～23 min，12%A；23～25 min，29%A；25～40 min，29%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（芍藥苷）、270 nm（淫羊藿苷、王不留行黃酮苷）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取淫羊藿苷、芍藥苷、王不留行黃酮苷對(duì)照品適量，加60%甲醇制成每毫升含40 μg、40 μg、10 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品內(nèi)容物研細(xì)，取約0.3 g 精密稱(chēng)定，加入60%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 按本膠囊生產(chǎn)工藝制備缺淫羊藿、白芍、王不留行藥材的陰性供試品樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 專(zhuān)屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性供試品溶液，精密吸取20 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。陰性供試品在對(duì)照品相同保留時(shí)間處未出現(xiàn)對(duì)應(yīng)色譜峰，表明陰性無(wú)干擾。

圖3 檢測(cè)波長(zhǎng)（A）230 nm、（B）270 nm 下的高效液相色譜圖

2.2.6 線(xiàn)性關(guān)系 精密稱(chēng)取淫羊藿苷、王不留行黃酮苷、芍藥苷對(duì)照品適量，加60%甲醇制成濃度分別為2、10、20、40、80、100、160、200 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣20μL。以濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。3 種成分在各自濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算得淫羊藿苷、王不留行黃酮苷和芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.12%、0.60%和0.14%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得淫羊藿苷、王不留行黃酮苷和芍藥苷的峰面積RSD 分別為0.52%、1.35%和0.24%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)16100791），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得淫羊藿苷、王不留行黃酮苷和芍藥苷含量的RSD 分別為0.29%、1.72%和0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取本品適量（批號(hào)171116ML），研細(xì)，取約0.15 g，精密稱(chēng)定，精密加入混合對(duì)照品溶液（含淫羊藿苷55.27 μg·mL-1、王不留行黃酮苷17.22 μg·mL-1、芍藥苷84.19 μg·mL-1）25 mL，再加入60%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果淫羊藿苷的回收率為103.94%～105.41%，平均回收率為104.90%，RSD 為0.53%（n=6）；王不留行黃酮苷的回收率為99.81%～101.70%，平均回收率為100.90%，RSD 為0.72%（n=6）；芍藥苷的回收率為100.99%～102.84%，平均回收率為102.00%，RSD 為0.69%（n=6）。

2.2.11 定量限 取“2.2.6”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（淫羊藿苷1.93 μg·mL-1、芍藥苷1.95 μg·mL-1、王不留行黃酮苷1.87 μg·mL-1）稀釋?zhuān)础?.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，信噪比為10 時(shí)，即為定量限，淫羊藿苷、王不留行黃酮苷、芍藥苷的定量限分別為0.89、4.65、4.30ng。

2.2.12 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，均在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 薄層色譜法展開(kāi)系統(tǒng)的篩選

在淫羊藿TLC 定性鑒別時(shí)，選擇以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水、三氯甲烷-甲醇-水下層溶液等[1]展開(kāi)劑進(jìn)行考察，最終確定了甲醇-丁酮-三氯甲烷-水（4∶6∶6∶1）作為展開(kāi)劑。在王不留行TLC 定性鑒別時(shí)，選擇以三氯甲烷-甲醇-水的下層溶液、甲醇-水、正丁醇-乙酸乙酯-水的上層溶液等[1，5]展開(kāi)劑進(jìn)行考察，均不太理想，最終確定了正丁醇-乙酸乙酯-水-甲酸（4∶1∶5∶0.5）的上層溶液作為展開(kāi)劑。

3.2 高效液相色譜法相關(guān)條件的篩選

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑（50%、60%、70%甲醇）、提取方法（超聲、靜置1 h 后超聲）、超聲提取時(shí)間（30、45、60 min）進(jìn)行了考察比較，最終確定供試品溶液提取方法為60%甲醇、超聲提取30 min。

本法采用DAD 檢測(cè)器，在190～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果淫羊藿苷、王不留行黃酮苷在波長(zhǎng)270 nm 附近有最大吸收，芍藥苷在波長(zhǎng)230 nm附近有最大吸收，故選擇270nm、230nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。