響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化制備祖卡木顆粒揮發(fā)油羥丙基-β環(huán)糊精包合物*

張艷軍，吳 靜

江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)與中藥學(xué)院，淮安 223005

祖卡木顆粒是維吾爾醫(yī)藥中長期用于治療感冒等癥的傳統(tǒng)維藥，臨床用此沖劑治療感冒咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕[1]。研究表明，祖卡木顆粒能明顯抑制炎性組織中PGE2、PGF1a 及TXB2的含量[2]，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用[3]。祖卡木顆粒由山奈、睡蓮花、薄荷、大棗、洋甘菊等10 味藥組成，其中薄荷、山奈、洋甘菊3 味藥材含有揮發(fā)油，且揮發(fā)油具有明確的藥理作用，如薄荷油具有疏風(fēng)、清熱的功效[4]，洋甘菊中的揮發(fā)油具有抗炎、抗病毒、抗過敏的作用[5]。由于揮發(fā)油成分容易揮發(fā)，在生產(chǎn)和儲存過程中容易流失，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油有效成分的含量受到影響，降低了藥效。

羥丙基-β 環(huán)糊精（HP-β-CD）是環(huán)糊精的衍生物，與環(huán)糊精相比，水溶性大大提高，與客體的結(jié)合常數(shù)提高，形成復(fù)合物的穩(wěn)定性增加，對肌肉無刺激性，且溶血性大大降低[6]。該品是一種理想的增溶劑和藥物賦形劑，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)。因此采用羥丙基-β 環(huán)糊精將祖卡木顆粒的揮發(fā)油進(jìn)行包合，以減低其揮發(fā)性，增加穩(wěn)定性，并使揮發(fā)油固體粉末化，便于制成顆粒劑，提高療效。本試驗采用飽和水溶液法制備包合物，采用Box-behnken的中心組合進(jìn)行實驗設(shè)計，利用響應(yīng)面方法對建立的模型進(jìn)行分析，以獲取最佳的制備工藝條件。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

78-1 型磁力加熱攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）；FA1004N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DZG6020 真空干燥箱（上海森信試驗儀器有限公司）；DWT-TW 型調(diào)溫電熱套、SHB-Ⅲ水循環(huán)真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

羥丙基-β 環(huán)糊精（江蘇豐園生物技術(shù)有限公司）；祖卡木顆粒揮發(fā)油（新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司）；試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物的制備

2.1.1 采用飽和水溶液法制備包合物 取一定量的羥丙基-β 環(huán)糊精，加入適量的蒸餾水，適宜溫度下制成飽和溶液。取一定量揮發(fā)油緩慢均勻滴加到羥丙基-β 環(huán)糊精飽和溶液中，在所需溫度下恒溫攪拌一定時間后，靜置于冰箱5 ℃冷藏24 h，抽濾，用石油醚洗滌3 次，40 ℃真空干燥8 h 即得包合物。

2.1.2 揮發(fā)油包合率、收得率的測定 按照《中國藥典》2015年版四部通則（0601）比重瓶法[7]測定揮發(fā)油相對密度為0.964 2；而揮發(fā)油含量的測定按照《中國藥典》2015年版四部通則（2204）揮發(fā)油測定方法甲法[8]。精密稱取一定量的包合物，置裝有沸石的圓底燒瓶中，加適量的蒸餾水，連接揮發(fā)油測定器，煮沸5 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0 線上面5mm 處為止。放置1h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發(fā)油量，按下式計算：

2.1.3 包合工藝的綜合評價指標(biāo) 包合率是衡量包合效果的重要指標(biāo)，包合率越高，揮發(fā)油的包合效果越好，穩(wěn)定性越高，故權(quán)重系數(shù)定為0.7。收得率在實際生產(chǎn)中具有重要意義，故權(quán)重系數(shù)定為0.3。

2.2 包合物的制備工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)包合物的制備工藝特點和預(yù)實驗，選擇對包合效果影響較大的三個因素作為考察因素，即羥丙基-β 環(huán)糊精與揮發(fā)油的料油比（A）、攪拌溫度（B）、攪拌時間（C），各因素選取三水平進(jìn)行考察，以包合率與收得率綜合評分為評價指標(biāo)，按照Box-behnken 中心組合設(shè)計原理進(jìn)行實驗設(shè)計。因素及水平表見表1；響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表2。

表1 Box-behnken 中心組合設(shè)計的因素水平表

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性分析 用Design-Expert.V8.0.6 軟件對表2 響應(yīng)面分析結(jié)果實施回歸擬合，同時對回歸模型作方差分析，結(jié)果見表3。

由表3 可知，模型的P 值小于0.000 1，說明回歸模型極顯著，失擬項不顯著，說明回歸方程擬合較好。模型的R2=0.996 1，R2Adj=0.991 1，可以較好地說明A、B、C 三個因素對包合率的影響。再者，方程中的一次項A、B、C 及二次項AB、AC 均對方程影響有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義，說明自變量與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。另外，通過F 值可以推測影響包合工藝的因素主次順序為：A＞C＞B，即料油比＞攪拌時間＞攪拌溫度。失擬項用來表示所用模型與實驗擬合的程度，P 值為0.114 8 ＞0.05，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

通過Design-Expert.V8.0.6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到包合率與收得率綜合評分和A、B、C 的二次多元回歸方程為Y=86.20-2.37A-0.55B -1.56C -1.25AB -0.85AC -0.63BC -5.82A2-3.31B2-1.84C2。

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果 根據(jù)回歸方程，可以繪出A、B、C 三個因素兩兩交互作用的響應(yīng)面分析圖和等高線圖。從兩圖中可直觀看出，各因素對響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面的最高點對應(yīng)的影響因素取值可判斷為最佳條件[9]，另外，兩因素間交互作用越顯著，其等高線圖形越接近于橢圓形，反之越接近于圓形。

由圖1 可知，攪拌溫度與料油比對包合效果的交互作用顯著，從等高線圖可以看出，沿料油比向峰值移動，等高線密度高于沿攪拌溫度移動的密度，表明料油比對包合效果的影響比攪拌溫度更為顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖1 攪拌溫度與料油比

由圖2 可知，攪拌時間與料油比的等高線圖形為橢圓形，表明攪拌時間與料油比對包合效果的交互作用非常顯著，從等高線圖可以看出，沿料液比向峰值移動，等高線密度高于沿攪拌時間移動的密度，表明料液比對包合效果的影響比攪拌時間更為顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖2 攪拌時間與料油比

由圖3 可知，攪拌時間與攪拌溫度的等高線圖形接近橢圓形，表明攪拌時間與攪拌溫度對包合效果的交互作用顯著，從等高線圖可以看出，沿攪拌時間向峰值移動，等高線密度高于沿攪拌溫度移動的密度，表明攪拌時間對包合效果的影響比攪拌溫度更為顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖3 攪拌時間與攪拌溫度

2.3 驗證試驗

利用響應(yīng)面軟件對所得的二次回歸方程進(jìn)行分析，得到祖卡木顆粒揮發(fā)油包合物制備的最佳工藝：料油比為8.6∶1；攪拌溫度為40 ℃；攪拌時間為128 min?；谏鲜鰲l件得到包合效果理論綜合得分為86.70%。最終將工藝修正為料油比為9∶1；攪拌溫度為40 ℃；攪拌時間為130 min。按照此條件進(jìn)行驗證試驗，得到包合物的收得率為86.67%±0.36%，包合率為86.52%±0.48%，綜合得分為86.40%±0.32%，與理論預(yù)測值（86.70%）相差0.30%，說明該優(yōu)化響應(yīng)面模型有效，可靠性好，能夠為祖卡木顆粒揮發(fā)油包合物制備工藝提供指導(dǎo)和幫助。

2.4 包合物穩(wěn)定性考察

2.4.1 光穩(wěn)定性考察 分別精密稱取適量祖卡木顆粒揮發(fā)油羥丙基-β 環(huán)糊精包合物和按比例混合的揮發(fā)油與羥丙基-β 環(huán)糊精混合物各3 份，在照度4 500 Lx 下放置10 天，于第0、3、5、10 天取樣，測定揮發(fā)油的含量，計算其保留率，結(jié)果見圖4。隨著光照時間的延長，包合物的揮發(fā)油含量呈逐漸下降的趨勢；但與混合物相比，包合物的揮發(fā)油含量降低速度緩慢。由此可見，包合物對光的穩(wěn)定性顯著增加。

圖4 光穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.2 熱穩(wěn)定性考察 精密稱取適量祖卡木顆粒揮發(fā)油羥丙基-β 環(huán)糊精包合物和按比例的揮發(fā)油與羥丙基-β 環(huán)糊精的混合物各3 份，于60 ℃恒溫干燥箱放置10 天，分別于第0、3、5、10 天取樣，測定揮發(fā)油的含量，計算揮發(fā)油保留率，結(jié)果見圖5。在60 ℃溫度下，兩者揮發(fā)油的含量在第3、5、10 天均有所下降，包合物下降速度緩慢；而混合物下降速度較明顯。由此可見，包合物的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于混合物。

圖5 熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.3 濕穩(wěn)定性考察 精密稱取適量祖卡木顆粒揮發(fā)油羥丙基-β 環(huán)糊精包合物和按比例的揮發(fā)油與羥丙基-β 環(huán)糊精的混合物各3 份，置于25 ℃、相對濕度92.5%（KNO3飽和溶液）條件下放置10 天，分別于第0、3、5、10 天取樣，測定揮發(fā)油的含量，計算揮發(fā)油保留率，結(jié)果見圖6。兩者揮發(fā)油含量在第3、5、10 天的含量均有所下降；但混合物下降較明顯。結(jié)果表明，包合物可以提高揮發(fā)油的濕穩(wěn)定性。

圖6 濕穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 討論

本實驗以羥丙基-β 環(huán)糊精為包合材料，對祖卡木顆粒揮發(fā)油進(jìn)行包合，以A、B、C 三個因素為考察項目，以包合率與收得率綜合評分為評價指標(biāo)，進(jìn)行Box-behnken 實驗設(shè)計，采用響應(yīng)面法對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳包合工藝：料油比9∶1；攪拌溫度40 ℃；攪拌時間130 min。在此條件下，包合效果綜合評價的實際值與響應(yīng)面法優(yōu)化得到的理論值比較接近。此外，對包合物的熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、濕穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，揮發(fā)油經(jīng)包合后，液態(tài)變成固體，避免了揮發(fā)，提高了揮發(fā)油的穩(wěn)定性。同時，羥丙基-β 環(huán)糊精立體結(jié)構(gòu)外部有多個親水性的醇羥基，增大了在水中的溶解度和溶解速率，從而提高了生物利用度。還解決了祖卡木顆粒中揮發(fā)油不穩(wěn)定的缺點，保證祖卡木顆粒的藥效[10]。