UPLC-MS/MS同時(shí)測定痔血合劑中8種成分含量

孫冰婷，趙 穎，龐 鵬

南京市中醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210001

痔血合劑是南京市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，全方由地榆炭、槐米炭、地黃、梔子炭、仙鶴草、當(dāng)歸炭等11味藥材組成，來源于名老中醫(yī)丁澤民教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有涼血止血、收斂止血之效，臨床用于咯血、吐血、肛裂、內(nèi)痔及便血，療效顯著[1]。目前文獻(xiàn)報(bào)道[2-8]的中藥飲片及中藥復(fù)方制劑中沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的含量測定方法大多采用HPLC 法或UPLC 法，且未見同時(shí)測定這8 種成分的報(bào)道。本文建立了UPLCMS/MS 方法同時(shí)檢測痔血合劑中上述8 種成分，該方法定量限低至納克級別，且每個(gè)樣品的分析僅需2 min，具有靈敏、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化提供借鑒。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1290 超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；API4000 LC-MS/MS 三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司），配有電噴霧化離子源（ESI），Analyst 1.4.2 色譜工作站；CPA225D 電子天平（德國Sartorius 公司）；Legend Micro 17R 冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）。

1.2 藥品與試劑

痔血合劑（批號171025、171227、180130），本院藥學(xué)部制劑；對照品：沒食子酸（純度90.8%，批號110831-201605）、蘆?。ㄅ?00080-201610）、梔子苷（純度97.6%，批號110749-201718）、槲皮苷（純度90.6%，批號111538-201606）、阿魏酸（純度99.0%，批號110773-201614）、柚皮苷（純度93.4%，批號110722-201714）、新橙皮苷（純度99.2%，批號111857-201703）、黃 芩苷（純 度93.5%，批 號110715-201619）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7 μm）；流動相：甲醇-水（含2 mmol·L-1甲酸銨）（65∶35）；流速：300 μL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

電噴霧離子化（ESI），負(fù)離子檢測，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子源電壓：4 000 V；離子源溫度：400 ℃。各成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8 種成分質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷對照品適量，用甲醇分別配制成1.002、1.037、1.014、1.020、0.999、1.008、1.032、1.056 mg·mL-1對照品 儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成6 個(gè)不同濃度的混合對照品系列溶液。

2.2.2 供試品溶液 吸取痔血合劑1 mL，置于100 mL 量瓶中，加甲醇80 mL，超聲30 min，放冷后甲醇定容，搖勻。吸取1 mL 該溶液于EP 管中，12000 r·min-1離心10 min 2 次，取上清液，用甲醇稀釋10倍，即得供試品溶液。

2.3 專屬性考察

在“2.1”色譜及質(zhì)譜條件下，沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的保留時(shí)間分別為0.89、1.12、1.02、1.23、0.96、1.07、1.09、1.08 min，基線平穩(wěn)，峰形良好，其它成分對測定無干擾，見圖1。

圖1 8 種成分的UPLC-MS/MS 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品系列溶液2 μL 進(jìn)樣分析。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見表2。8 種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取含8 種成分的低、中、高濃度混合對照品溶液（分別含沒食子酸10.00、50.00、200.0 ng·mL-1，蘆 丁80.00、400.0、1 600 ng·mL-1，梔子苷20.00、100.0、400.0 ng·mL-1，槲皮苷1.000、5.000、20.00 ng·mL-1，阿魏酸1.000、5.000、20.00 ng·mL-1，柚皮苷80.00、400.0、1600 ng·mL-1，新橙皮苷80.00、400.0、1600 ng·mL-1，黃芩苷20.00、100.0、400.0 ng·mL-1），按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，平行測定3 份，測定色譜峰峰面積并計(jì)算精密度。結(jié)果表明，低、中、高3 種濃度沒食子酸的RSD 分別為1.39%、2.06%、0.29%；蘆丁的RSD 分別為1.77%、1.84%、2.30%；梔子苷的RSD 分別為3.39%、0.46%、1.48%；槲皮苷的RSD 分別為0.12%、0.76%、2.47%；阿魏酸的RSD 分別為2.04%、2.47%、2.11%；柚皮苷的RSD 分別為3.09%、4.29%、2.46%；新橙皮苷的RSD 分別為1.39%、3.27%、0.79%；黃芩苷的RSD 分別為4.11%、2.36%、0.37%。儀器精密度良好。

表2 8 種成分的線性關(guān)系

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為171025 的痔血合劑樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6 份，按“2.1”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測得沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的RSD 分別為1.89%、2.24%、1.66%、3.83%、3.04%、2.30%、3.29%、1.85%。表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

吸取批號為171025 的痔血合劑已知含量樣品500 μL，分別精密加入沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的對照品溶液，置于100 mL 量瓶中，加甲醇80 mL，超聲30 min，放冷后甲醇定容，搖勻。吸取該溶液1 mL 于EP管中，12 000 r·min-1離心10 min 2 次，取上清液，用甲醇稀釋10 倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定8 種成分的含量，計(jì)算加樣收回率，結(jié)果見表3。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、4、8、12、24h，按“2.1”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測得沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷和黃芩苷峰面積的RSD 分別小于2.87%、4.12%、5.11%、1.36%、2.43%、0.60%、7.32%、2.58%（n=3）。表明8 種成分在室溫下放置24h 均穩(wěn)定。

表3 8 種成分的加樣回收率

2.9 含量測定

3 批痔血合劑按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算沒食子酸、蘆丁、梔子苷、槲皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的含量，平行測定3 次，結(jié)果見表4。3 批制劑中8 種成分含量基本穩(wěn)定。

表4 痔血合劑中8 種成分的含量測定結(jié)果（μg·mL-1，n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜柱對分離效果的影響。先后選用Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18色譜柱（2.00 mm×100 mm，3 μm）、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），發(fā)現(xiàn)小粒徑Acquity 色譜柱得到的峰形較尖、峰高更高。

對流動相考察時(shí)選取乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水（含2 mmol·L-1甲酸銨）等，結(jié)果顯示，選用乙腈為有機(jī)相時(shí)，沒食子酸、阿魏酸、柚皮苷、黃芩苷峰形不佳；選用甲醇-水（含2 mmol·L-1甲酸銨）為流動相時(shí)，8 種成分均峰形較好，靈敏度較高。

對8 種成分的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在負(fù)離子模式下均響應(yīng)良好，故以負(fù)離子模式檢測。