蟾毒靈通過下調(diào)PKM2抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

石 婷，張 雯，周 群，朱余兵

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）藥學(xué)部，南京 210006

腫瘤細(xì)胞的“瓦伯格效應(yīng)”與糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的異常表達(dá)密切相關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，M2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）在腫瘤糖酵解及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7-9]。同時(shí)也有研究報(bào)道，黑色素瘤具有高度活躍的糖酵解進(jìn)程，且PKM2 呈過表達(dá)狀態(tài)，提示PKM2 可能是抑制黑色素瘤侵襲與轉(zhuǎn)移并能有效治療黑色素瘤的潛在靶點(diǎn)[10]。

蟾毒靈（bufalin）作為一種甾體類化合物，是中藥蟾酥中的主要活性成分，也是蟾酥發(fā)揮抗腫瘤的主要活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、強(qiáng)心、調(diào)節(jié)免疫等生理活性[11，12]。越來越多的研究顯示，蟾毒靈對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用[13]，然而關(guān)于蟾毒靈對(duì)黑色素瘤增殖、侵襲及其相關(guān)機(jī)制的研究尚未有明確報(bào)道。因此，本研究旨在考察蟾毒靈對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，以及對(duì)黑色素瘤細(xì)胞糖酵解過程的影響，并對(duì)其相關(guān)作用機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材 料

1.1 材料與藥品、試劑

人源A375 黑色素瘤細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）。

蟾毒靈（純度＞95%，上海安耐吉化學(xué)有限公司）；乳酸測試盒（南京建成生物工程研究所）；丙酮酸激酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；絲氨酸（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

Western blot 所涉及抗體：GAPDH（Bioworld 公司）；PKM2（SAB 公司）；MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin（CST 公司）。

Transwell 小室（美國Corning 公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)311，Thermo Fisher Scientific）；酶標(biāo)儀（型號(hào)Synergy2，美國Bio Tek）；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)GelDoc 2000，美國Bio-Rad）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞增殖的影響

A375 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基、在培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化后離心，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/mL，接種于96 孔板中，每孔200 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞增長至約75%左右時(shí)，分別加入不同濃度的蟾 毒靈（1、2、4、8、16、32、64、128 nmol·L-1）以 及 對(duì)照溶劑，孵育24 h 后吸棄上清液，每孔加入MTT 100μL 繼續(xù)培養(yǎng)4h 后吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO 振蕩10 min，在490nm 波長下測定吸光度值（A）。

圖4所示為氯氣物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為0.02%的氮?dú)怏w系中氯氣的吸附穿透曲線（吸附壓力為0.3 MPa，氮?dú)饬髁繛?5 mL/min，室溫）。分析可知，兩種活性炭基脫氯劑均具備微量氯深度凈化性能，均能將氯含量脫除至物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)小于0.00002%。但相比而言，CT-01I具備更優(yōu)的微量氯深度凈化性能，其氯穿透時(shí)間為61.3 min，遠(yuǎn)優(yōu)于AC-101的44.6 min。

細(xì)胞增殖活力（%）=（1－A實(shí)驗(yàn)組/A溶劑對(duì)照組）×100%。重復(fù)3 次。

2.2 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞乳酸分泌和葡萄糖消耗的影響

將A375 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞濃度為7.5×104個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁生長至約70%后，吸棄上清液，PBS 蕩洗一次，加入含不同濃度的蟾毒靈，并設(shè)定溶劑對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)上清液，同時(shí)用胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)，根據(jù)檢測試劑盒的操作說明測定乳酸、葡萄糖含量，以每105個(gè)細(xì)胞分泌的乳酸、消耗的葡萄糖作為結(jié)果分析。

2.3 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞丙酮酸激酶活力的影響

將A375 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞濃度為7.5×104個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁生長至約70%后，吸棄上清液液，PBS 蕩洗一次，加入含不同濃度的蟾毒靈，并設(shè)定溶劑對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后胰酶消化細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液，測定上清液蛋白含量，依據(jù)試劑盒操作說明檢測蛋白上清液中丙酮酸激酶的活力。

2.4 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)：將A375 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁生長至80%～90%，吸棄上清液，PBS 蕩洗一次，用10 μL 槍頭沿孔的中線垂直劃痕，PBS 蕩洗兩次后，加入含不同藥物的無血清培養(yǎng)基，分別設(shè)4 個(gè)組：溶劑對(duì)照組、絲氨酸組（Serine，1 mmol·L-1）、蟾毒靈組（8 nmol·L-1）、絲氨酸（1 mmol·L-1）+蟾毒靈（8 nmol·L-1）組。于0 h、24 h 分別在倒置顯微鏡下拍照。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)：待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，提前一天用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，次日胰酶消化后重懸細(xì)胞。在transwell 小室（24 孔板）內(nèi)鋪上50 μL的基質(zhì)膠，在24 孔板中加入含15%的胎牛血清培養(yǎng)基，上室中加入含不同藥物的用無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液100 μL（1×106個(gè)/mL），分別設(shè)4 個(gè)組：分組同“2.4”該節(jié)劃痕試驗(yàn)。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出小室，PBS 蕩洗后用棉簽擦去小室內(nèi)多余的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，晾干，利用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，PBS 蕩洗3 次，于倒置顯微鏡下拍照，計(jì)算穿膜后在膜底部貼壁的細(xì)胞數(shù)量。

2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測蟾毒靈對(duì)PKM2 及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

將A375 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁生長至約70%后，吸棄上清液，PBS 蕩洗一次，加入含不同濃度的蟾毒靈，并設(shè)定溶劑對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以胰酶消化細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液，檢測上清液蛋白含量，確定蛋白上樣量。通過SDS-PAGE凝膠電泳后，將凝膠中的蛋白通過濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗膜5次，每次10 min。然后加入對(duì)應(yīng)的一抗孵育，4 ℃過夜，回收一抗，用TBST 洗膜5 次，每次10 min。室溫孵育二抗2 h，TBST 洗膜5 次，每次10 min。使用ECL 發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 蟾毒靈對(duì)黑色素瘤A375 細(xì)胞增殖的影響

為了確定蟾毒靈對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375 增殖的影響，利用MTT 實(shí)驗(yàn)考察了蟾毒靈干預(yù)細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，蟾毒靈能夠有效抑制A375 細(xì)胞的增殖活力，當(dāng)干預(yù)時(shí)間為24 h，蟾毒靈在濃度為16 nmol·L-1時(shí)就能顯著抑制A375 細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。見圖1。為了排除細(xì)胞增殖對(duì)蟾毒靈干預(yù)細(xì)胞的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用的蟾毒靈濃度為1、2、4、8 nmol·L-1。

3.2 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞乳酸生成、糖耗量及丙酮酸激酶的影響

圖1 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞增殖的影響（n=3）

多數(shù)腫瘤細(xì)胞即使在氧氣條件充足的情況下，仍然選擇有氧糖酵解作為主要功能方式，其主要特征是葡萄糖消耗增加以及乳酸生成增多[5，6]。為了考察蟾毒靈是否對(duì)A375 細(xì)胞有氧糖酵解有抑制作用，首先考察了蟾毒靈對(duì)A375 黑色素瘤細(xì)胞乳酸生成及糖耗量的影響。如圖2-A 和圖2-B 所示，蟾毒靈能夠劑量依賴性的抑制A375 細(xì)胞的乳酸生成量和葡萄糖消耗量。其次，繼續(xù)考察了蟾毒靈對(duì)糖酵解中關(guān)鍵激酶—丙酮酸激酶的影響。如圖2-C 所示，蟾毒靈干預(yù)A375 細(xì)胞后，顯著抑制了A375 細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶的活力，表明蟾毒靈可能通過抑制丙酮酸激酶，進(jìn)而下調(diào)了A375 細(xì)胞內(nèi)的糖酵解水平，抑制A375 細(xì)胞的增殖。

3.3 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲的影響

圖2 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞糖酵解和丙酮酸激酶的影響

有研究顯示，腫瘤細(xì)胞的糖酵解進(jìn)程與腫瘤遷移、侵襲密切相關(guān)，過度活化的糖酵解進(jìn)程能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[6]。因此進(jìn)一步考察了蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲的影響，并利用PKM2的激動(dòng)劑干預(yù)，探討了PKM2 在蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲過程的作用。如圖3-A 所示，在劃痕實(shí)驗(yàn)中，蟾毒靈干預(yù)A375 細(xì)胞后顯著抑制了A375細(xì)胞的水平遷移能力；而PKM2 激動(dòng)劑絲氨酸促進(jìn)了A375 的遷移，當(dāng)蟾毒靈與絲氨酸共同干預(yù)后，絲氨酸的促遷移作用被顯著逆轉(zhuǎn)。在transwell 小室實(shí)驗(yàn)中也得到了相一致的結(jié)果（見圖3-B）。這些結(jié)果表明，蟾毒靈抑制A375 細(xì)胞的遷移與侵襲能力與下調(diào)PKM2 相關(guān)。

圖3 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲的影響（n=6）

3.4 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞中PKM2 及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

有報(bào)道關(guān)于，PKM2 的過表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲，并且能夠調(diào)控腫瘤侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)[8，9]。為了進(jìn)一步明確蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞增殖與侵襲的抑制作用與PKM2 的相關(guān)性，考察了蟾毒靈對(duì)PKM2 及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。Western blot 結(jié)果顯示，蟾毒靈能抑制A375 細(xì)胞中PKM2 的蛋白表達(dá)（見圖4-A）；并且能下調(diào)促進(jìn)腫瘤侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9 和N-cadherin 的表達(dá)，上調(diào)抑制腫瘤侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin 的表達(dá)（見圖4-B）。以上結(jié)果提示，蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用與其下調(diào)細(xì)胞內(nèi)糖酵解進(jìn)程和PKM2 的表達(dá)相關(guān)。

圖4 蟾毒靈對(duì)A375 細(xì)胞中PKM2 及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n=3）

4 討論

現(xiàn)代研究表明，腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解促進(jìn)了腫瘤的增殖與侵襲，其中糖酵解過程中的關(guān)鍵限速酶-PKM2 的高表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解高度活躍的關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一[14]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，PKM2 的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的增殖與侵襲[15，16]，提示過度表達(dá)的PKM2 有可能通過加速腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟾毒靈能顯著抑制A375 黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力；而在對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著影響的劑量下，蟾毒靈能抑制A375 細(xì)胞的有氧糖酵解及丙酮酸激酶的活力，并能顯著抑制A375 的遷移與侵襲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在加入PKM2 激動(dòng)劑絲氨酸[17]的條件下，蟾毒靈能逆轉(zhuǎn)絲氨酸對(duì)A375細(xì)胞遷移與侵襲的促進(jìn)效應(yīng)。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞中的PKM2 能調(diào)控多種與腫瘤侵襲的相關(guān)蛋白，包括MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin[18]，其中MMP-2、MMP-9、N-cadherin 的過表達(dá)與E-cadherin 的低表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲。在本研究中發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈能劑量依賴性的抑制PKM2 的蛋白表達(dá)，同時(shí)對(duì)MMP-2、MMP-9、N-cadherin 也有顯著的抑制效應(yīng)，對(duì)于E-cadherin 具有促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究表明，蟾毒靈可能通過抑制A375 黑色素瘤細(xì)胞有氧糖酵解過程中的關(guān)鍵酶PKM2，進(jìn)而下調(diào)MMP-2、MMP-9、N-cadherin 的表達(dá)，并上調(diào)了E-cadherin 的表達(dá)，從而抑制了A375黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

本研究初步探討了蟾毒靈對(duì)A375 黑色素瘤細(xì)胞有氧糖酵解過程中的關(guān)鍵酶PKM2 的影響，提示通過抑制腫瘤細(xì)胞中PKM2 的表達(dá)可以成為抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲的一種途徑，為研發(fā)靶向PKM2 的抗腫瘤藥物提供了一個(gè)新的思路。