龍牙百合總黃酮的索氏提取工藝正交優(yōu)化及抗氧化性研究

傅春燕，羅聰，龍佳欣，湯俊穎，胡悅，張亞蘭

(邵陽學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 邵陽,422000)

龍牙百合(Liliumbrowniivar.viridulum)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生宿根草本植物。湖南邵陽每年種植龍牙百合面積約為4×106m2，年凈產(chǎn)約3×106kg，產(chǎn)值高達(dá)1.05億元，已成為當(dāng)?shù)氐奶厣a(chǎn)業(yè)[1]。百合味甘，性寒，歸心、肺經(jīng)，養(yǎng)陰潤肺，清心安神，用于陰虛燥咳，勞咳嗽血，虛煩驚悸，失眠多夢(mèng)，精神恍惚[2]。百合鱗莖含有豐富的皂苷[3]、黃酮[4]、多糖[5]、酚類化合物[6]等活性化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，百合具有止咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗疲勞、降血糖、抗腫瘤、抗抑郁等活性[7-9]。黃酮類化合物(flavonoids)是一類含有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的天然化合物，具有非常強(qiáng)大的抗氧化和清除活性氧的能力,可以防止自由基攻擊DNA而誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和抗腫瘤等多方面具有顯著的藥理活性[10],在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[11]。本研究以湖南特產(chǎn)龍牙百合為原料，采用索氏提取方法，通過單因素水平實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究了龍牙百合總黃酮的最佳提取工藝和含量測(cè)定，并與維生素C作對(duì)比進(jìn)行清除自由基能力的抗氧化性實(shí)驗(yàn)，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用龍牙百合總黃酮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將新鮮的龍牙百合鱗莖(購于湖南省邵陽百合種植基地)放置60 ℃恒溫箱中烘干，粉碎，過60目篩，密封冷藏，備用。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等化學(xué)藥品均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080-200707)，純度≥98%(中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 主要儀器

主要儀器見表1。

表1 主要儀器Table 1 Main instruments

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確取20 g龍牙百合鱗莖粉，用濾紙卷好置于250 mL索氏提取器中，按料液比為20∶100 g/mL加入濃度為75%乙醇100 mL，提取時(shí)間90 min，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，殘?jiān)?0%乙醇溶解，定容至50 mL，備用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制步驟及過程見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制步驟及過程Fig.1 Drawing procedure and process of rutin standard curve

1.3.3 龍牙百合總黃酮含量測(cè)定

取上述待測(cè)樣品溶液4.00 mL，置于 25 mL容量瓶中，按1.3.2方法，靜置15 min后,在510 nm波長下測(cè)定吸光度A，根據(jù)回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液中的龍牙百合總黃酮的含量(mg/mL)，換算出樣品中總黃酮的含量(mg/g)。

1.3.4 總黃酮提取率的計(jì)算

總黃酮提取率(%)=(提取液中總黃酮質(zhì)量/ 百合粉末量)×100%。

1.3.5 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液和稀釋后的供試樣品，分別按“1.3.2”的方法對(duì)樣品顯色后，分別放置0、8、15、30、60 min，紫外分光光度法測(cè)定樣品總黃酮的吸光度，考察樣品顯色后的穩(wěn)定性。

1.3.6 提取方法的篩選

在乙醇濃度為75%，料液比為20∶80 g/mL、提取時(shí)間為30 min的條件下分別采用微波提取法、超聲波提取法、索氏提取法和加熱回流提取法四種方法進(jìn)行提取，對(duì)得到的總黃酮分別用分光光度法測(cè)定其含量，篩選出最佳的提取方法。

1.3.7 單因素水平實(shí)驗(yàn)

(1)提取時(shí)間的篩選：在乙醇濃度為75%，料液比為20∶80 g/mL的條件下，分別比較不同提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取率的影響。(2)料液比的篩選：在乙醇濃度為75%，提取時(shí)間為120 min的條件下，分別比較不同料液比(20∶80、20∶100、20∶150、20∶200、20∶250 g/mL)對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取率的影響。(3)乙醇濃度的篩選：在料液比為20∶200 g/mL，提取時(shí)間為120 min條件下，分別比較不同乙醇濃度(55%、65%、75%、85%、95%)對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取率的影響。

1.3.8 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取時(shí)間(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)為考察因素，采用 L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表2，以總黃酮提取率為指標(biāo)，確定龍牙百合鱗莖的最佳提取工藝。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平Table 2 Factor and level of orthogonal experiment

1.3.9 方法重現(xiàn)性試驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果，同時(shí)做6個(gè)平行樣品，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.10 抗氧化活性研究

按照本課題組報(bào)道過的抗氧化性活性的研究方法[12]，采用最優(yōu)提取方法提取龍牙百合鱗莖總黃酮，將提取出的黃酮液按比例稀釋，濃度分別為1.000、0.500、0.250、 0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL，進(jìn)行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)抗氧化性試驗(yàn)。取2 mL稀釋后的各濃度龍牙百合鱗莖總黃酮提取液及2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，以純?nèi)軇┳鲄⒈热芤?，?10 nm波長下用分光光度法測(cè)定吸光度。根據(jù)下列公式計(jì)算龍牙百合總黃酮提取液對(duì) DPPH·自由基的清除率[12-13]：

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

其中Ai為加入 DPPH·試劑后樣品溶液的吸光度；Aj為未加入DPPH·試劑時(shí)樣品溶液的吸光度；Ac為加入 DPPH·試劑后空白對(duì)照溶液的吸光度。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用同樣的方法測(cè)定相同濃度維生素C溶液對(duì) DPPH·的清除能力。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 Origin 8.0、SPSS 13.0 軟件進(jìn)行處理并作差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，可知該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=14.487x-0.004，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

2.2 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品顯色后放置的時(shí)間對(duì)總黃酮的吸光度的影響如圖3所示，隨著放置時(shí)間的延長，總黃酮的吸光度有一定的影響，在0～15 min內(nèi)，對(duì)照品吸光度的RSD=2.56%(n=6)，樣品吸光度RSD=3.25%(n=6)，說明0～15 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，為最適宜的測(cè)定時(shí)間。

圖3 放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.3 The effect of placement time on absorbency

2.3 提取方法優(yōu)化

如圖4所示，同一條件時(shí)采用微波提取，超聲波提取，索氏提取和加熱回流提取四種方法進(jìn)行比較，其中索氏提取法的提取的總黃酮提取率最高，優(yōu)選索氏提取法進(jìn)行總黃酮提取工藝研究。

圖4 提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extraction method on the extraction rate of total flavonoids

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響

在乙醇濃度為75%，料液比為20∶80 g/mL的條件下，提取的總黃酮含量隨著提取時(shí)間的增大而逐漸增加。出于能源和實(shí)驗(yàn)時(shí)間方面綜合考慮，得出龍牙百合總黃酮提取的最佳時(shí)間為120 min(見圖5)。

圖5 提取時(shí)間對(duì)龍牙百合總黃酮提取的影響Fig.5 Effect of extraction time on total flavonoids extraction from Lilium brownii

2.4.2 料液比對(duì)總黃酮提取的影響

在提取乙醇濃度為75%，提取時(shí)間120 min的條件下，總黃酮提取率隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到20∶200 g/mL時(shí)，總黃酮提取率高達(dá)約4.20%。故龍牙百合總黃酮提取的最佳料液比應(yīng)為20∶200 g/mL(見圖6)。

圖6 料液比對(duì)龍牙百合總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of material/liquid ratio on total flavonoids extraction from Lilium brownii

2.4.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮的影響

如圖7所示，在提取料液比為20∶200 g/mL，提取時(shí)間120 min的條件下，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到75%時(shí)，總黃酮的提取率最高，之后隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，總黃酮的提取率顯著降低。當(dāng)乙醇濃度增加后提取液中出現(xiàn)橙色小油滴，這是由于高濃度的乙醇會(huì)溶解更多的雜質(zhì)，從而降低總黃酮的提取率。故提取總黃酮的最佳乙醇濃度為75%。

圖7 乙醇濃度對(duì)龍牙百合葉總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on total flavonoids extraction from Lilium brownii

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3、4可以得出結(jié)論，提取時(shí)間(C)對(duì)總黃酮提取率的影響在4個(gè)因素中最大。通過對(duì)比分析，提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率具有顯著性影響(P< 0.01)，其他因素對(duì)總黃酮提取率影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

把B合并到D誤差項(xiàng)中，形成一個(gè)新的誤差，初步判斷最佳工藝為A2C1。既然B和C都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且B被合并到誤差項(xiàng)，R值越大，極差越大，表明該因素的水平改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大[14]。因此，3個(gè)因素對(duì)龍牙百合總黃酮提取率的主次影響因素的順序?yàn)椋篈(提取時(shí)間)>C(乙醇濃度)>B(料液比)。考慮到生產(chǎn)成本，以及綜合各方面因素確定最佳提取工藝為A2B1C1，即提取時(shí)間為90 min，料液比為 20∶100 g/mL，乙醇濃度為75%。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of L9(34)orthogonal experiment

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

注：F0.01(2,4)=18.00，F(xiàn)0.05(2,4)=6.94，P<0.01

2.6 方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)最優(yōu)提取方法，用6個(gè)平行樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出總黃酮提取率為(3.815 ± 0.35)%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.02%。該結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，提取物總黃酮含量高于所有正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這表明本實(shí)驗(yàn)研究提取工藝穩(wěn)定合理，重現(xiàn)性較好。

2.7 比較不同濃度的龍牙百合總黃酮與維生素C的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

龍牙百合總黃酮對(duì)穩(wěn)定脂性自由基DPPH·具有清除作用，從圖8可以看出，不同濃度的龍牙百合總黃酮和維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除率均隨著濃度的上升而升高，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系，龍牙百合鱗莖總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除率始終高于相同濃度的維生素C溶液。

圖8 龍牙百合總黃酮提取液和維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除率比較 Fig.8 Comparison of scavenging rate of total flavonoids extract from Lilium brownii and vitamin C solution to DPPH·

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以龍牙百合鱗莖為原料，采用索氏提取法提取龍牙百合總黃酮。在單因素實(shí)驗(yàn)的水平上，采取正交實(shí)驗(yàn)法，確定龍牙百合鱗莖提取總黃酮的最佳工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，索氏提取法對(duì)龍牙百合總黃酮提取率的3個(gè)因素影響為:提取時(shí)間>乙醇濃度>料液比。最佳提取條件為：提取時(shí)間90 min、料液比為20∶100 g/mL、乙醇濃度75%。在此條件下，得到龍牙百合總黃酮提取率為(3.815 ± 0.35)%。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同濃度條件下，龍牙百合總黃酮對(duì)DPPH·的清除率與維生素C溶液相比，前者效果更佳，說明龍牙百合總黃酮具有更好的清除DPPH·的能力。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，總黃酮的提取方法有熱水提取法、加熱回流醇提法、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法、酶解法等[15]。這些方法有些是不適合工業(yè)化生產(chǎn)的，例如熱水提取法、加熱回流醇提法等，雖然提取物中總黃酮的含量較高，但是因?yàn)殡s質(zhì)較多造成其純化程序增加，造成生產(chǎn)成本提高。索氏提取方法是一種常用的、測(cè)定結(jié)果可靠的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于總黃酮和粗脂肪的提取。索氏提取法利用溶劑回流和虹吸原理，讓純?nèi)軇┻B續(xù)不斷萃取固體物質(zhì)，既節(jié)約溶劑同時(shí)也提高了萃取效率[16]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)際，選用更適合工藝生產(chǎn)的索氏提取法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

該實(shí)驗(yàn)采用索氏提取法初步研究了龍牙百合鱗莖總黃酮提取工藝和抗氧化活性，為綜合開發(fā)和利用湖南本地藥食兩用中藥材——龍牙百合提供理論依據(jù)，為深入研究龍牙百合活性成分與藥理活性提供參考。