發(fā)酵食品中抗氧化乳酸菌的篩選與鑒定

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

1956年英國學(xué)者Harmna首先提出了自由基衰老學(xué)說。自由基衰老理論(FRTA)認為細胞的老化變化是由自由基反應(yīng)引起的[1]。1990年美國衰老研究權(quán)威Sohal教授指出了自由基衰老理論的缺陷[2]，并首次提出了氧化應(yīng)激的概念。氧化應(yīng)激即機體自由基生成增加或清除能力降低，引起機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的功能紊亂，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)積累而引起的一系列氧化損傷過程[3]。多種研究證明：氧化應(yīng)激不僅與衰老有著密不可分的關(guān)系，氧化應(yīng)激還與腫瘤的發(fā)生，哮喘、抑郁癥及各種慢性炎癥等疾病息息相關(guān)[4-6]。氧化應(yīng)激還參與心血管疾病的病理生理過程，引發(fā)動脈粥樣硬化、心力衰竭、高血壓和心肌損傷等[7]。

機體自身的抗氧化能力有限，因此，通過攝入外源性的抗氧化劑已成為機體緩解氧化應(yīng)激的重要途徑。文獻報道具有抗氧化活性的微生物有乳酸菌、酵母菌，及某些致病菌，如炭疽病菌等[8]。其中，乳酸菌是一種被人類廣泛利用的益生菌，常常被應(yīng)用在食品發(fā)酵工業(yè)及微生態(tài)制劑中。普通酸奶中僅添加保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌，而這兩種菌是“一過性”的保健菌，它們絕大多數(shù)不會進入腸道，不能起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[9]。因此，現(xiàn)在越來越多的發(fā)酵乳中也開始添加除了保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌以外的益生菌。目前，全球公認的益生菌有雙歧桿菌、乳桿菌等。其中短乳桿菌是乳桿菌屬中的重要種群之一，其具有高產(chǎn)酸、去除亞硝酸鹽和產(chǎn)細菌素等功能[10]，尤其是短乳桿菌在發(fā)酵食品中去除亞硝酸鹽的作用顯著，具有用量小、作用快和使用方便等特點[11]。此外，Shakibaie等[12]發(fā)現(xiàn)一株富硒短乳桿菌，具有作為含硒添加劑的潛力。益生菌類保健品在國外已經(jīng)發(fā)展了許多年，近幾年益生菌制品在國內(nèi)市場上逐漸得到認可?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌能夠清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，羥自由基等活性氧自由基，緩解細胞氧化應(yīng)激[13-14]。乳酸菌作為天然食品添加劑能緩解機體氧化應(yīng)激以及一些疾病的發(fā)生。因此，篩選具有較好緩解氧化應(yīng)激功能的乳酸菌具有重要研究意義及應(yīng)用前景。本研究通過體外抗氧化實驗從傳統(tǒng)自制的發(fā)酵食品中篩選出具有緩解氧化應(yīng)激功能的益生菌菌株，以期為開發(fā)具有緩解氧化應(yīng)激功能的乳酸菌食品發(fā)酵劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統(tǒng)自制的發(fā)酵蔬菜：蘿卜、白菜、長豇豆和芥菜；嬰兒糞便，采集于25 d健康嬰兒；MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，檸檬酸二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，磷酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫-80 1 mL；二苯基苦基苯肼自由基(Sigma生物試劑有限公司)；DNA抽提試劑盒，由生工生物工程(上海)股份有限公司出品；API50試劑條(生物梅里埃中國有限公司)；鄰菲羅琳、過氧化氫、硫酸亞鐵和抗壞血酸等試劑(均為國產(chǎn)分析純)。

生化培養(yǎng)箱(型號SPX-250B-Z，上海博迅實業(yè)有限公司)；紫外/可見分光光度計(型號UV1000，上海天美科學(xué)儀器有限公司)；超聲波破碎儀(SONICS，型號VCX500) ；臺式高速冷凍離心機(Thermo，型號Stratos)；聚合酶反應(yīng)儀(Eppendorf，型號Mastercycler)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

使用一次性無菌注射器采集發(fā)酵蔬菜的湯汁，保存于已滅菌的EP管中。對嬰兒糞便進行無菌采集，采樣后樣品封口膜封口，均保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌的分離純化

將樣品用生理鹽水進行梯度稀釋，將稀釋后的樣品均勻涂布于pH為5.0的MRS固體培養(yǎng)基上，放入37 ℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。

觀察菌落形態(tài)，挑選符合乳酸菌形態(tài)的菌落進行3 次劃線純化。對純化后的菌落進行革蘭氏染色和接觸酶實驗。革蘭氏染色陽性，接觸酶實驗為陰性的菌株可初步判定為乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌耐受性實驗

1) 乳酸菌的耐酸性測定：將活化后的菌株，以3%的接種量分別接種于pH為2.0，3.0，4.0，6.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h。16 h后測其在600 nm處的吸光值。

2) 乳酸菌的膽鹽耐受能力測定：將活化的菌株，以3%的接種量接種于分別含有0，0.3%，0.5%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h。16 h后測其在600 nm處的吸光值。

3) 乳酸菌的過氧化氫耐受能力測定：將活化的菌株按3%接種于過氧化氫濃度分別為0.4，0.7，1.0 mmol/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h。16 h后測其在600 nm處的吸光值。

1.2.4 乳酸菌體外抗氧化能力測定

1) 樣品的處理

樣品處理參考Lin等[15]的方法。完整細胞懸液：將菌以1%接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h后4 ℃，4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，收集的菌體經(jīng)PBS(pH為7.2)洗滌3 次，再懸浮于PBS中，調(diào)整菌數(shù)至1×109cfu/mL。

胞內(nèi)提取物：將上述菌數(shù)為1×109cfu/mL的完整細胞懸液激進行超聲破碎，功率400 W，工作5 s，停5 s，60 次。破碎后將懸液4 ℃，10 000 r/min離心10 min，收集上清。

2) DPPH清除能力測定

取0.2 mmol/mL的DPPH 1 mL，加1 mL處理過的乳酸菌樣品充分混勻后，室溫避光反應(yīng)30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清，測定其在波長517 nm處的吸光度Ai，對照組(AO)以等體積PBS代替樣品。以等體積PBS和無水乙醇調(diào)0[16-17]，其表達式為

3) 羥自由基清除能力測定

4) 抗脂質(zhì)過氧化能力測定

在新鮮的雞蛋黃中1︰1加入PBS，磁力攪拌10 min后用PBS稀釋成1︰25的蛋黃懸液。取1 mL蛋黃懸液，0.5 mL樣品，1 mL PBS和1 mL FeSO4(25 mmol/L)溶液混勻，37 ℃保溫1.5 h。然后加入1 mL三氯乙酸(TCA，質(zhì)量分數(shù)為2.5%)，室溫靜置10 min，3 500 r/min，離心10 min。取上清加入2 mL的硫代巴比妥酸(TBA，質(zhì)量分數(shù)為0.8%)，充分混勻后沸水浴10 min；冷卻后于532 nm處測定吸光度A1。A0用等量的樣品溶劑(即PBS)代替樣品[19]，其表達式為

5) 還原活性分析

在0.5 mL的菌懸液中依次加入0.5 mL PBS，0.5 mL鐵氰化鉀(質(zhì)量分數(shù)為1%)，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，4 000 r/min離心5 min。取上清1 mL加入1 mL蒸餾水和三氯化鐵(質(zhì)量分數(shù)為0.1%)混合均勻，反應(yīng)10 min后于700 nm處測定其吸光值，用L-半胱氨酸作為標品[20]。

1.2.5 菌種鑒定

1) 16S rDNA：將乳酸菌ZJ401過夜培養(yǎng)后，取適量菌液利用試劑盒提取全基因組。得到的全基因組用16S通用引物進行PCR(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，將PCR產(chǎn)物送至公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對。

2) API50CH菌種鑒定：用API50CH及API50CHL進行乳酸菌的生理生化鑒定，操作步驟按照說明書進行。

3) 生長曲線分析：取50 mL已發(fā)酵24 h的菌液離心棄上清，用生理鹽水洗滌后再離心棄上清，置于烘箱中烘干至恒重(65 ℃，24 h)，測其干重，以此為依據(jù)分別計算出1, 2, 4, 5, 6, 8, 10 mL發(fā)酵液的菌體干重。另取1, 2, 4, 5, 6, 8, 10 mL菌液，離心棄上清后用生理鹽水重懸浮混勻定容至25 mL，分別測其OD600 nm，得到吸光值OD600 nm與菌體干重的生物量標準曲線。另以1%的接種量將乳酸菌ZJ401接種于MRS液體培養(yǎng)基中，每隔2 h取一定量菌液進行OD600 nm測定和pH測定。

1.2.6 統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3 次，采用SPSS 19.0的單因素方差分析顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離純化

從10 種不同來源的樣品中分離得到34 株菌，革蘭氏染色均為陽性，接觸酶實驗均為陰性。因此初步鑒定這34 株菌為乳酸菌，菌落形態(tài)為乳白色，表面光滑，邊緣整齊的圓形菌落，鏡檢下可看到這34 株菌為長桿狀或短桿狀。

2.2 乳酸菌耐受性

2.2.1 乳酸菌的耐酸性

乳酸菌需要有較好的耐酸性才能在胃酸環(huán)境下維持活性，對34 株菌進行了耐酸性試驗后發(fā)現(xiàn)其中有6 株乳酸菌的耐酸性較好，圖1為6株乳酸菌在不同pH條件下的生長情況。圖1中：小寫字母a～f表示同一菌株在不同pH條件下的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。從圖1中可看出：當pH為6，7時，乳酸菌的OD600 nm最高活性最好，說明pH在6.0到7.0左右是這幾株菌的最佳培養(yǎng)條件。6株菌均能在pH為4.0的壞境下生長，其中ZJ906的活性最差。當pH為3.0時，只有ZJ401還具有活性，其余5 株菌均無法生長。當環(huán)境pH為2.0時，所有菌株的生長水平與初始一致，所有菌株均無法生長。正常人體的胃液pH最低可達2以下，人體消化不同食物的時間在30 min到4 h不等。因此在pH越低的環(huán)境下具有耐受性的乳酸菌越能在胃酸中維持活性，到達腸道。由上可看出ZJ401具有較好的耐酸性。

圖1 乳酸菌在不同pH條件下的生長情況Fig.1 The growth of Lactic acid bacteria at different pH conditions

2.2.2 乳酸菌的膽鹽耐受性

乳酸菌要順利到達腸道，除了需要具有一定的耐酸能力以外，還需要具有一定的膽鹽耐受能力，正常人體腸道中膽鹽質(zhì)量分數(shù)在0.03%～0.3%波動，乳酸菌在此膽鹽濃度下具有活性就有可能在腸道中定植。圖2為6 株乳酸菌在不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)下的生長情況，圖2中：小寫字母a～d表示同一菌株在不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)條件下的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。從圖2中可以看到：膽鹽對這6 株乳酸菌活性影響均較大，但這幾株乳酸菌在膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.5%的培養(yǎng)條件下都具有活性，說明這幾株乳酸菌對膽鹽有一定耐受能力。

圖2 乳酸菌在不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)下的生長情況Fig.2 The growthof Lactic acid bacteria at different concentrations of bile salts

2.2.3 乳酸菌的H2O2耐受能力

H2O2是一種弱氧化劑，會引起人體的氧化損傷。乳酸菌對H2O2的耐受性是篩選緩解氧化應(yīng)激乳酸菌的重要指標之一。表1為6 株乳酸菌在不同H2O2濃度下的生長情況。從表1可看出：隨著過氧化氫濃度的升高，對除ZJ803以外的菌株生長有一定的影響。但是菌株的存活率均較高，因此這6 株乳酸菌對過濃度為1 mmol/L的過氧化氫都具有耐受性。

表1 乳酸菌在不同過氧化氫濃度下的生長情況

Table 1 Thegrowth of Lactic acid bacteria at different concentrations of hydrogen peroxide

菌株編號OD600 nm0 mmol/L0.4 mmol/L0.7 mmol/L1.0 mmol/LZJ3022.38±0.01a2.07±0.04b1.98±0.02b2.03±0.05bZJ3121.86±0.02a1.76±0.03b1.77±0.03b1.79±0.01bZJ4011.88±0.02a1.72±0.01c1.75±0.02b1.70±0.02dZJ8032.30±0.01a2.31±0.01a2.30±0.02a2.29±0.01aZJ8042.32±0.01b2.39±0.01a2.16±0.01c2.07±0.03dZJ9061.81±0.02a1.75±0.01b1.73±0.02c1.69±0.01d

注：右上標小寫字母a～d表示同一菌株在不同過氧化氫濃度條件下的顯著性分析，字母相同表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。

2.3 乳酸菌體外抗氧化能力

2.3.1 DPPH清除率

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除實驗常用于抗氧化能力的評價實驗中。當自由基清除劑存在時，DPPH 自由基接受一個電子或氫原子，形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，使其乙醇溶液從深紫色變?yōu)辄S色，變色程度與其接受的電子數(shù)量(自由基清除活性)成定量關(guān)系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析[21]。對6 株乳酸菌進行DPPH清除率實驗，發(fā)現(xiàn)其中ZJ302，ZJ804的DPPH清除率均低于5%，其余4 株菌DPPH清除率均在10%之上，如圖3所示。圖3中：小寫字母a～c表示同一種狀態(tài)下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。DPPH清除率最高的兩株菌是ZJ401，ZJ803，且發(fā)現(xiàn)4 株乳酸菌的無細胞提取物的DPPH清除率均略高于完整菌體，但是實驗發(fā)現(xiàn)ZJ803的DPPH清除率實驗的重復(fù)性較差。

圖3 DPPH清除率Fig.3 DPPH clearance rate

2.3.2 羥自由基清除能力

芬頓反應(yīng)是過氧化氫和二價鐵離子催化反應(yīng)生成具有強氧化能力的羥基自由基，目前芬頓反正也廣泛應(yīng)用于抗氧化能力的評價實驗中，如圖4所示。圖4中：小寫字母a～d表示同一種狀態(tài)下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。從圖4可以看到：4 株菌中ZJ401的羥自由基清除能力最好，其次是ZJ803，ZJ312，羥自由基清除能力最差的是ZJ906。與DPPH清除率實驗相同，4 株菌的無細胞提取物的羥自由基清除能力均高于完整菌體。

圖4 羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate

2.3.3 抗脂質(zhì)過氧化能力

采用硫代巴比妥酸法進行抗脂質(zhì)過氧化能力的測定，其原理是不飽和體系的氧化產(chǎn)物與硫代巴比妥酸的反應(yīng)物在532 nm處有一個強吸收峰，如圖5所示。圖5中：小寫字母a～d表示同一種狀態(tài)下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。如圖5所示，抗脂質(zhì)過氧化能力最好的是ZJ401，其次是ZJ803。而ZJ312的完整菌體與ZJ906的無細胞提取物均沒有檢測到抗脂質(zhì)過氧化能力。

圖5 抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.5 Anti-lipid peroxidation

2.3.4 乳酸菌還原活性

還原能力與抗氧化活性有一定的相關(guān)性，因此還原能力的測定常用于評價抗氧劑活性。如表2所示，ZJ906的還原活性最好，其次是ZJ401，且與DPPH清除率與羥自由清除率一樣，4 株菌的無細胞提取物的還原活性均高于完整菌體的還原活性。

表2 乳酸菌還原活性Table 2 Lactic acid bacteria reduction activity 單位：μmol/L

注：右上標小寫字母a～d表示同一種狀態(tài)下不同菌株之間的顯著性分析，字母相同表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。

綜合上述4 個抗氧化實驗可以發(fā)現(xiàn)：4 株乳酸菌均有一定的抗氧化活性，其中綜合抗氧化活性最好的是ZJ401，其無細胞提取物DPPH清除率可達25.68%，羥自由基清除率為23.72%，還原活性相當于104.67 μmol/L L-半胱氨酸。且從4 個抗氧化實驗結(jié)果可以看出：不同的抗氧化實驗結(jié)果有一定的相關(guān)性。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 16S rDNA

ZJ401的16sr DNA的PCR擴增產(chǎn)物如圖6所示，擴增條帶單一，且擴增片段大小在1 500 bp左右。將PCR擴增產(chǎn)物送至公司進行雙向測序，拼接后的序列在NCBI上進行BLAST比對。結(jié)果顯示與ZJ401序列同源性最高的菌株為短乳桿菌(相似度99%，序列號NR 116238.1)。

選取同源性高的典型菌種序列，對ZJ401與其發(fā)育關(guān)系相近的菌株進行遺傳距離計算。應(yīng)用MAGE 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，圖7為ZJ401進化樹。

M—標準DNA分子量；1，2，3—ZJ401。圖6 菌株ZJ401的基因組PCR電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of PCR products of ZJ401

圖7 ZJ401進化樹Fig.7 Evolutionary trees of ZJ401

2.4.2 API50CH

對ZJ401進行生理生化鑒定，試劑條結(jié)果如表3所示，將試劑條結(jié)果通過API Lab進行分析與鑒定。結(jié)果顯示菌株ZJ401的鑒定結(jié)果為短乳桿菌，其ID值(鑒定百分率)為99.6%，T值(T指數(shù))為1.0。結(jié)合16S rDNA序列對比結(jié)果和API50CH生理生化結(jié)果，鑒定ZJ401為短乳桿菌。

表3 API50CH生理生化鑒定結(jié)果Table 3 API50CH physiological and biochemical identification results

表3 (續(xù))

注：+表示反應(yīng)呈陽性；-表示反應(yīng)呈陰性。

2.4.3 生長曲線

對抗氧化活性最佳的ZJ401進行生長曲線的測定，結(jié)果如圖8所示。6 h時生長進入對數(shù)期，18 h以后菌體生長進入平穩(wěn)期，短乳桿菌ZJ401的對數(shù)生長期為6～18 h。發(fā)酵液的pH從最初的6.0最后降到4.4。

圖8 ZJ401生長曲線Fig.8 The growth curve of ZJ401

3 結(jié) 論

隨著科技進步和生活水平的提高，細胞抗氧化與抗衰老越來越多地為人們所關(guān)注。細胞氧化應(yīng)激損傷與衰老及多種疾病都有著密不可分的關(guān)系。本實驗從各種發(fā)酵食品中篩選得到34 株乳酸菌，經(jīng)耐酸耐膽鹽及耐過氧化氫實驗得到6 株耐受性較好的乳酸菌，通過DPPH清除率，羥自由清除率，還原活性，抗脂質(zhì)過氧化率實驗對菌株的體外抗氧化性進行了鑒定，確定了一株具有優(yōu)良抗氧化性的短乳桿菌，命名為ZJ401。ZJ401具備優(yōu)良的體外抗氧化活性和益生性能，為后續(xù)乳酸菌的菌種選育，食品發(fā)酵工業(yè)中功能性抗氧化食品發(fā)酵劑的研制，以及新型的益生活菌制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。