膽堿膳食應激小鼠腸道菌群及代謝

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

腸道是人體最大的消化器官和微生態(tài)系統(tǒng)。研究表明：腸道內(nèi)定居的菌群被認為是與宿主協(xié)同工作的一種類似免疫系統(tǒng)的細胞群體，能促進健康，但有時會引發(fā)疾病，具有遺傳和環(huán)境因素的個體差異性[1]。而在環(huán)境因素中，膳食因素在調節(jié)腸道菌群組成中起著關鍵作用。前期文獻報道，改變膳食模式會影響腸道菌群的結構[2]。最近，在大量臨床樣本和動脈粥樣硬化易感小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)：小腸微生物代謝膳食磷脂酰膽堿、膽堿和左旋肉堿產(chǎn)生TMAO，促進動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)和心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)的進程[3-8]。該發(fā)現(xiàn)已經(jīng)受到國內(nèi)外研究者的廣泛關注。膽堿是機體細胞膜的重要組成部分，是維持人體肝臟和肌肉正常功能所必需的一種營養(yǎng)素[9-10]。膳食膽堿可以從日常生活中獲得，如紅肉和雞蛋，但也可以化學合成。然而，在生活中，特別在西方膳食模式下，人們會攝入大量高膽堿食物。目前，關于高膳食膽堿與健康小鼠腸道微生態(tài)之間的聯(lián)系卻鮮有報道。

因此，筆者建立1%的膳食膽堿健康小鼠模型，應用宏基因組測序及相關測定方法，研究高膽堿飲食對腸道菌群及代謝的影響，以期進一步探索膽堿生理功能，為人們合理、健康的飲食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

20 只SPF(無特定病原體，Specific pathogen free)級健康C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體重(20±2) g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，寄養(yǎng)于浙江工業(yè)大學實驗動物中心動物房；1%膽堿飼料購自上海福貝世亨實驗動物飼料有限公司，成分見表1；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸均購自Sigma-Aldrich；小鼠脂多糖ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；鋅和鐵標準品購于國家有色金屬和電子材料分析測試中心。

表1 小鼠飼料營養(yǎng)成分Table 1 Nutrient contents of mice fodder

1.2 實驗樣本與處理

20 只C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于晝夜交替環(huán)境中，實驗用水和食物均采用高溫消毒滅菌。小鼠適應環(huán)境一個星期后，隨機平分成兩組，即正常組(CK)和1%膳食膽堿組(CHO)。CK組小鼠不做處理，攝入普通飼料；CHO組每天飼喂含1%的高膽堿飼料。每周記錄小鼠體重，觀察小鼠成長情況。在實驗前后分別收集新鮮小鼠糞便，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗周期?0 d，處死前禁食12 h，眼球取血，脫頸處死，血液樣品存于-20 ℃下待用。

1.3 DNA提取

收集CK和CHO組實驗前后每只小鼠200 mg糞便，同組混合，共4 個樣本。即對照組(CK組)和膽堿組(CHO組)分別在0 d和60 d收集的小鼠糞便。利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒從糞便中提取混合宏基因組DNA。

1.4 高通量測序和生物學分析

首先將提取得到的腸道DNA進行PCR擴增和純化回收，然后利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照質量比1∶1等量混合后測序。

1.4.1 原始序列數(shù)據(jù)

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別分析轉化為原始測序序列，其中包含測序序列的序列信息以及其對應的測序質量信息。

1.4.2 數(shù)據(jù)預處理

Miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，將成對的序列拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質量進行質控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.4.3 去除嵌合體及非特異性擴增序列

在PCR反應過程中，會由于延伸不完全產(chǎn)生一些嵌合體，同時也會產(chǎn)生一些非特異性擴增序列。為了保證信息分析質量，必須對其進行剔除。使用Usearch去除預處理后序列中非擴增區(qū)域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調用Uchime進行鑒定嵌合體。隨后，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進行Blastn比對，低于閾值的比對結果被認為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列。

1.4.4 腸道菌群組成的生物學分析

眾多序列按其序列間的距離進行聚類，然后根據(jù)序列與序列間的相似性當作域值分為操作分類單元(OTU)，一般域值的序列相似性設定為0.97，則被認為可能屬于屬。對處理后序列進行物種分類，采用的軟件為RDP classifier，RDP classifier是基于Bergey’s taxonomy，采用Na?ve Bayesian assignment算法對每條序列在genus水平上計算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分類閾值，則說明此分類結果可信(測序片段長度<250時可適當調低此值到0.5，如只測V3，V6，V4區(qū)。Bergey’s taxonomy分為6 層，它們依次為域(domain)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)。本實驗主要在門綱目科屬水平上進行優(yōu)勢菌群的分析，探索1%膽堿飲食對小鼠腸道菌群組成的影響。

1.5 糞便SCFA測定

取100 mg糞便樣品置于10 mL離心管中，加入1.6 mL去離子水溶解，渦旋振蕩2 min，加入0.4 mL體積分數(shù)為50%的硫酸溶液和1.5 mL乙醚，250 r/min的搖床中搖晃45 min，然后3 000 r/min離心5 min。取上清液于干凈的試管中，加入10 mg無水氯化鈣脫水，過0.22 μm濾膜，乙醚定容至1 mL進樣安捷倫氣相色譜。

色譜條件如下：色譜柱為菲羅門ZB-FFAP色譜柱；程序升溫條件為100 ℃保留2 min，8 ℃升到240 ℃保持10 min后230 ℃運行10 min；進樣口溫度250 ℃；FID 350 ℃；以N2為載氣，流速為1.69 mL/min。

1.6 血漿中LPS測定

采用小鼠(Mouse)脂多糖ELISA檢測試劑盒，操作如下：1) 室溫平衡20 min后從鋁箔袋中取出所需板條；2) 設置標準品和樣本孔；3) 標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔先加待測樣品20 μL，再加樣本稀釋液30 μL，空白孔不加；4) 標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min(空白孔不加)；5) 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗板5 次；6) 每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)于450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.7 糞便微量元素測定

采用原子吸收分光光度法(AAS)測定糞便中微量元素鐵和鋅的質量分數(shù)。1) 稱取60 mg干燥后的糞便，加入5 mL 體積分數(shù)為65%的硝酸和2 mL高氯酸過夜；2) 隔天樣品在電爐加熱礦化至冒白煙顏色澄清，然后澄清液轉移至容量瓶，去離子水定容到25 mL，過膜備用；3) 空白組制備方法同樣品(不加入糞便)；4) 建立標準曲線：用去離子水稀釋標準品制備0.1，0.5，1，2，5 mg/L的標準品溶液。

1.8 統(tǒng)計學處理

兩組實驗的定量數(shù)據(jù)結果用均值±標準差(SD)表示。統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 7軟件進行T檢驗分析(GraphPad software, La Jolla, CA)。P值小于0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 膳食膽堿對小鼠體重的影響

如圖1所示，各組小鼠的體重隨著時間的增長而增加，行動活躍，被毛平整光滑，飲食情況無明顯變化并且在整個實驗過程中都保持健康，說明長期攝入1%膽堿飲食對小鼠健康沒有顯著影響。

圖1 小鼠體重隨時間變化圖Fig.1 Body weight of mice changes over time

2.2 膳食膽堿對小鼠腸道菌群組成的影響

腸道菌群由上萬億個典型的不致病的共生微生物組成，在維持機體正常代謝和生理功能中起重要作用[11]。腸道菌群組分和功能的改變在慢病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，維持腸道菌群組分的平衡穩(wěn)定是決定宿主健康的重要因素。目前，1%膽堿飲食對健康小鼠腸道微生態(tài)的作用研究較少，因此，筆者探索了1%膽堿膳食對小鼠腸道菌群的影響。

2.2.1 膳食膽堿對小鼠腸道菌群門水平組成的影響

由圖2可知：實驗前后各組小鼠門水平上腸道菌群主要的優(yōu)勢菌為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，它們的豐度占總菌屬80%以上。低豐度的菌群包括軟壁菌門(Tenericutes)和放線菌門(Actinobacteria)。處理60 d后，CHO組厚壁菌門豐度增加，擬桿菌豐度降低，提高了厚壁菌豐度與擬桿菌豐度的比值，而CK組趨勢則相反。由各組處理前后門水平菌群豐度變化可知，1%膽堿膳食能顯著影響腸道菌群組成。

CK—對照組；CHO—膳食膽堿組；1—實驗處理前；2—實驗處理后。圖2 膳食膽堿對小鼠腸道菌群門水平的影響Fig.2 Effects of choline diet on gut microbiota on phylum level

2.2.2 膳食膽堿對小鼠腸道菌群屬水平組成的影響

由圖3可知：在屬水平上，各組豐度較高的菌主要為毛螺桿菌NK4A136組(LachnospiraceaeNK4A136 group)、幽門螺桿菌屬(Helicobacter)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、擬桿菌屬(Bacteroides)、另之菌屬(Alistipes)和葉桿菌屬(Phyllobacterium)。其中，與CK組相比，1%膽堿飲食干預后毛螺桿菌NK4A136組和另之菌屬豐度增加，屬于有益菌，與腸道抗炎相關[12-13]。圖3中顏色深淺代表實際樣本菌群豐度高低。

圖3 膳食膽堿對小鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.3 Effects of choline diet on gut microbiota in genus level

2.2.3 膽堿飲食處理對TMAO相關菌的影響

小鼠糞便菌群16s RNA基因組經(jīng)PCR擴增之后進行宏基因組測序，分析了膳食膽堿處理后TMAO產(chǎn)生相關菌的豐度變化，結果如圖4所示。

圖4 膳食膽堿對TMAO產(chǎn)生菌的影響Fig.4 Effects of choline diet on TMAO producing bacteria

由圖4可知：與CK組相比，高膽堿膳食顯著增加厚壁菌門、梭菌目(Clostridiales)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)豐度，降低擬桿菌門、擬桿菌目(Bacteroidales)的豐度，而對變形桿菌門和顫桿菌克屬(Oscillibacter)豐度影響小。膽堿作為機體日常必需的一種營養(yǎng)素，廣泛存在于雞蛋、紅肉和魚肉中。前期無菌小鼠和人體實驗研究表明，厚壁菌門和變形菌門與TMAO產(chǎn)生相關[14]。而Cho等發(fā)現(xiàn)健康志愿者攝入TMAO前體食物后，可造成體內(nèi)厚壁菌門增加和擬桿菌門缺乏，其與TMAO產(chǎn)生相關[15]。在本研究中，高膽堿飲食可顯著增加厚壁菌門/擬桿菌門豐度的比例，這與以往的報道相一致。同時，梭菌目、瘤胃球菌科、梭菌屬(Clostridirales)、顫桿菌克屬(Oscillibacter)以及鏈球菌屬(Streptococcus)的豐度與血漿TMAO水平具有相關性[16-18]。梭菌目被認為含有代謝膳食膽堿生成TMAO的CutC/D基因[19]。在本研究中，1%膽堿飲食對TMAO相關菌豐度的影響與前期研究報道一致。以上數(shù)據(jù)表明：高膽堿飲食能提高腸道TMAO產(chǎn)生菌的豐度，具有促CVD產(chǎn)生的風險。

2.3 膳食膽堿消耗提高糞便SCFA質量分數(shù)

SCFA是腸道菌群利用宿主不易消化的糖類、蛋白或內(nèi)源性底物等酵解而產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物，其組成和總量可以間接反應人體厭氧菌的數(shù)量和代謝情況，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸[20-21]。以往研究揭示：SCFA具有多種生理功能，包括供能、促進脂肪和糖代謝、改善腸道微循環(huán)、抗炎和免疫調節(jié)的作用[22]。在本研究中，1%膽堿飲食對糞便SCFA的影響如圖5所示。與CK相比，CHO組乙酸質量分數(shù)顯著增加，而丙酸、丁酸和戊酸的質量分數(shù)沒有顯著差異。以上數(shù)據(jù)表明：對于健康小鼠，高膽堿膳食能促進乙酸的產(chǎn)生。圖5中*代表P<0.05。

圖5 糞便中短鏈脂肪酸質量分數(shù)Fig.5 The contents of SCFA in mice feces

2.4 高膽堿飲食對糞便微量元素的影響

鐵和鋅是兩種人體重要的微量營養(yǎng)元素，其在腸道內(nèi)被吸收，轉運到肝臟、肌肉和血液利用，而后通過糞便、尿液和汗水排出。如圖6所示，相對于CK組，CHO組顯著增加糞便Fe的質量分數(shù)，而Zn的質量分數(shù)沒有顯著性變化。早期文獻報道：體內(nèi)低水平的Fe能提高與其他毒性金屬作用的敏感性，保護機體健康[23]。本研究CHO組小鼠糞便中Fe的質量分數(shù)增加，說明高膽堿膳食促進體內(nèi)Fe的排出。圖6中*代表P<0.05。

圖6 膳食膽堿對糞便微量元素的影響Fig.6 Effects of choline dietry on trace nutrition elements in feces

2.5 高膽堿飲食對血漿LPS水平的影響

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一，高水平的細菌LPS會從腸腔進入血液引起體內(nèi)毒素血癥和全身性的低度炎癥[24]。腸黏膜屏障是腸道健康的生物屏障，能阻止有害物質進入血液，如LPS。由圖7可知：CHO組小鼠血漿LPS濃度顯著降低。最近Zhang等研究報道，補充0.5%的膽堿能明顯改善孕婦血清LPS和炎癥水平[25-28]，筆者研究結果與前期文獻相類似。1%膽堿飲食對腸黏膜屏障具有保護作用。圖7中*代表P<0.05。

圖7 血漿LPS濃度Fig.7 The concentration of plasma LPS

3 結 論

1%高膽堿飲食可影響健康小鼠腸道微生態(tài)，其作用表現(xiàn)在正負兩個方面：1) 1%高膽堿飲食能提高腸道抗炎相關菌毛螺桿菌NK4A136組的豐度，增加糞便中SCFA含量，并降低血漿中LPS的水平，起到保護腸黏膜屏障作用；2) 1%高膽堿飲食提高了TMAO相關產(chǎn)生菌厚壁菌門、梭菌目、瘤胃球菌科的豐度，具有增加CVD的風險。因此，如何合理、安全地利用膽堿將是未來重要的研究課題。