生物制造“細(xì)胞工廠”的設(shè)計(jì)與組裝

劉波，陶勇

生物制造“細(xì)胞工廠”的設(shè)計(jì)與組裝

劉波，陶勇

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

以化石資源為原料的化學(xué)品制造行業(yè)在消耗不可再生資源的同時(shí)，還對生態(tài)環(huán)境造成了破壞，這給以可再生資源為原料的生物制造帶來了發(fā)展機(jī)遇。與傳統(tǒng)化工制造不同，生物制造把細(xì)胞作為“生產(chǎn)車間”，“車間”內(nèi)每一道工序由酶催化完成?！凹?xì)胞工廠”除了反應(yīng)條件溫和，還具有較強(qiáng)的可塑性，可根據(jù)需求調(diào)整或者重構(gòu)代謝途徑來合成各種目標(biāo)化學(xué)品?！凹?xì)胞工廠”的設(shè)計(jì)過程遵循如下的準(zhǔn)則：1) 構(gòu)建一條由原料到產(chǎn)品的最優(yōu)合成途徑；2) 平衡代謝途徑中每步反應(yīng)的代謝流，使該途徑代謝通量遠(yuǎn)高于細(xì)胞基礎(chǔ)代謝；3) 足量地供應(yīng)合成途徑的前體，多個(gè)前體根據(jù)需要調(diào)整供應(yīng)比例；4) 酶促反應(yīng)往往有各種輔因子的參與，順暢的代謝通路需要平衡或者再生各種輔因子；5) 通過遺傳改造或者工藝改進(jìn)解除產(chǎn)物和代謝中間體的反饋抑制，以獲取更高的產(chǎn)量。

生物制造，細(xì)胞工廠，設(shè)計(jì)與組裝

作為一種原料可再生和環(huán)境友好型的生產(chǎn)方式，生物制造得到了越來越多的關(guān)注和研發(fā)投入，生物制造可利用諸如淀粉、木質(zhì)纖維素和油脂等生物質(zhì)資源合成能源化學(xué)品和平臺化合物。早在20世紀(jì)早期，由于市場對丙酮和丁醇等化學(xué)品有強(qiáng)烈的需求，從而促進(jìn)了ABE (Acetone-butanol- ethanol) 發(fā)酵的發(fā)展。1916年以丙酮丁醇梭菌為宿主的ABE發(fā)酵首次實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[1,2]，至20世紀(jì)中期，采用ABE發(fā)酵生產(chǎn)方式大約占66%的丁醇和10%的丙酮的市場份額[8]，隨著石油化工的迅速發(fā)展，ABE發(fā)酵的生產(chǎn)方式已不具備成本優(yōu)勢，逐漸被石油化工替代。當(dāng)前，出于對資源短缺和環(huán)境問題的考慮，以及得益于代謝工程的發(fā)展，ABE發(fā)酵重新得到重視，代謝工程改造的菌株以葡萄糖為原料生產(chǎn)丁醇的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到了10.7 g/(L·h)[4-5]，據(jù)估算當(dāng)前丁醇生物制造的成本根據(jù)原料的不同大約為0.8至2美元每千克[6]，在不久的將來有可能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。生物制造丁醇的發(fā)展經(jīng)歷了一百多年，從ABE發(fā)酵的建立與工業(yè)化應(yīng)用，到被石油化工生產(chǎn)所替代，再到如今重新得到重視，生產(chǎn)成本一直是影響生物制造工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素。作為生物制造的核心，細(xì)胞工廠 (菌株) 的性能決定著產(chǎn)品生物合成的生產(chǎn)強(qiáng)度、效價(jià)和轉(zhuǎn)化率等，這些指標(biāo)又直接影響著產(chǎn)品的發(fā)酵成本和提取成本。因此高效率細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)與組裝是生物制造實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的前提與關(guān)鍵。在本文，我們結(jié)合當(dāng)前常用的代謝工程改造策略以及實(shí)例，闡述在細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和組裝中所要遵循的一些準(zhǔn)則。

1 途徑設(shè)計(jì)

與石化工廠中某個(gè)化學(xué)品單一的生產(chǎn)線不同，細(xì)胞工廠是一個(gè)多種化合物和生化反應(yīng)共存的混合體，所有這些化合物組成一個(gè)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，它的本能是滿足細(xì)胞自身的生存和分裂。要在這么復(fù)雜的體系中合成目標(biāo)化學(xué)品，首先需要設(shè)計(jì)一條最優(yōu)的合成途徑。途徑設(shè)計(jì)有兩種方法，一種是基于已知的生化反應(yīng)途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)，這方面有許多可供參考的數(shù)據(jù)庫，例如綜合了基因、酶、化合物、生化反應(yīng)和代謝途徑的KEGG數(shù)據(jù)庫[20]，以生化反應(yīng)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的BRENDA數(shù)據(jù)庫[32]，以及整理了各種生物基因的功能與調(diào)控的數(shù)據(jù)庫Metacyc[3]等；另一種是在已有認(rèn)知的基礎(chǔ)上，通過建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型，進(jìn)行合理的推測，該方法主要應(yīng)用于新合成途徑的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。目前已有許多模型建立，例如RDM方法[28]、PPS系統(tǒng)結(jié)合UMBBD數(shù)據(jù) 庫[17]和BNICE框架結(jié)合ATLAS數(shù)據(jù)庫[10,13]等。所有這些方法均通過設(shè)定一些規(guī)則來計(jì)算得到新的反應(yīng)和代謝途徑，其中PPS系統(tǒng)是基于已知的生化反應(yīng)數(shù)據(jù)庫來演算，其生化反應(yīng)的預(yù)測規(guī)則存在局限；RDM與上述方法則不同，它基于化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行推演，結(jié)果具有更廣泛的預(yù)測性，但可靠度有所降低；同樣是基于已有的數(shù)據(jù)庫來演算，BNICE框架采取了多樣性的規(guī)則來囊括已有的生化反應(yīng)和預(yù)測新的生化反應(yīng)，從而使其能夠更加有效地預(yù)測新的生化反應(yīng)和代謝途徑。

以3-羥基丙酸的途徑設(shè)計(jì)為例，Henry 等[15]采用BNICE框架以丙酮酸為出發(fā)前體進(jìn)行推演，不僅重現(xiàn)了已知的合成途徑 (圖1A)，還成功地預(yù)測了若干新的合成途徑 (圖1B)。以丙酮酸為出發(fā)前體，已知的合成途徑中，無論是經(jīng)過Malonyl-CoA、β-丙氨酸中間體，亦或者是Acryloyl-CoA中間體，合成途徑至少需要四步酶催化，而采用BNICE框架預(yù)測的代謝途徑最短可由兩步反應(yīng)完成。假設(shè)n步生化反應(yīng)的代謝途徑中某一步生化反應(yīng)的實(shí)際摩爾轉(zhuǎn)化率為Yn，那么由原料至終產(chǎn)品的實(shí)際轉(zhuǎn)化率Y=Y1·Y2·Y3·...·Yn，由于Yn≤1，那么代謝途徑越長，實(shí)際可實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化率越低，也就暗示生產(chǎn)成本越高，而途徑越短實(shí)際轉(zhuǎn)化率提升的難度也就越小，因此在化學(xué)品合成的途徑設(shè)計(jì)中，應(yīng)盡可能地選擇較短的合成途徑，但這一原則并非一成不變的，因?yàn)橛行┹^短的合成途徑從熱力學(xué)上來講并非是有利的。

采用eQuilibrator來計(jì)算圖1B中兩步反應(yīng)和三步反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變 (Δ, equilibrator.weizmann.ac.il)[11]，經(jīng)乳酸的兩步反應(yīng)途徑Δ° = +29.6 kJ/mol，經(jīng)草酰乙酸的三步反應(yīng)途徑Δ° = ?10.1 kJ/mol。雖然丙酮酸和3-羥基丙酸之間轉(zhuǎn)化的Δ° = +29.5 kJ/mol，但是由于代謝途徑不同，所以整體上的能量變化也有所差異。因此從計(jì)算的角度來講經(jīng)草酰乙酸中間體合成3-羥基丙酸的途徑具有較大的優(yōu)勢，新設(shè)計(jì)的代謝途徑需要新的生化反應(yīng)才能實(shí)現(xiàn)，該三步反應(yīng)代謝途徑中，催化草酰乙酸至丙二酸半醛的反應(yīng)理論上存在，但至今仍未被發(fā)現(xiàn)，未來或許可通過新酶設(shè)計(jì)等手段實(shí)現(xiàn)該代謝途徑?？傮w上來講，代謝途徑的設(shè)計(jì)要依次考慮途徑中的生化反應(yīng)數(shù)量、熱力學(xué)可行性以及生化反應(yīng)實(shí)際的可執(zhí)行性。

圖1 3-羥基丙酸的生物合成途徑[15]

2 代謝流平衡

生物依賴初級代謝來合成胞內(nèi)各種前體化合物和提供能量，用于維持細(xì)胞的生存和分裂，對于微生物來說，過多的合成氨基酸、有機(jī)酸和某種蛋白等并不利于其生存，生物可通過調(diào)控基因的表達(dá)和酶的催化活力來控制碳代謝流分布，使其在諸如糖酵解、三羧酸 (TCA) 循環(huán)和磷酸戊糖途徑等初級代謝中的比例處于最有利于生長的狀態(tài)，這也被稱作是“初級代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性”[34]，當(dāng)目標(biāo)化學(xué)品為參與初級代謝的化合物時(shí)，細(xì)胞工廠的構(gòu)建就無法避免地要考慮初級代謝和化學(xué)品合成途徑間的平衡，初級代謝的剛性會使改造存在一定困難。例如2015年Song等[33]改造大腸桿菌合成β-丙氨酸過程中發(fā)現(xiàn)，單純過表達(dá)來源于大腸桿菌的天冬氨酸脫羧酶PanD，并沒有檢測到β-丙氨酸的生成，因此他們對初級代謝途徑進(jìn)行了一系列的改造，包括敲除乙醛酸途徑負(fù)調(diào)控因子基因和延胡索酸酶基因，此時(shí)仍未檢測到β-丙氨酸的生成，直至他們過表達(dá)天冬氨酸合酶AspA，才檢測到了0.855 g/L的β-丙氨酸。由此可見初級代謝網(wǎng)絡(luò)具有較強(qiáng)的剛性，碳代謝流的分布對目標(biāo)化合物產(chǎn)量的提升有較大的影響，隨后他們采用不同強(qiáng)度過表達(dá)的PEP羧化酶 (由基因編碼)，將碳代謝流盡可能地引向L-天冬氨酸，最終可合成3.94 g/L的β-丙氨酸 (圖2)。

在細(xì)胞工廠的構(gòu)建過程中，除了要考慮基礎(chǔ)代謝與合成途徑的平衡，合成途徑中的每一步反應(yīng)也需要優(yōu)化與調(diào)整，以防止某一中間體過多的積累，對細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面的影響。2003年Jay D Keasling實(shí)驗(yàn)室首次公開報(bào)道了在大腸桿菌中構(gòu)建外源MVA途徑 (甲羥戊酸類異戊二烯合成途徑)，通過將外源基因引入大腸桿菌，他們成功地構(gòu)建了 一條由七步生化反應(yīng)組成的DMAPP合成途徑，并以此為基礎(chǔ)合成了青蒿素的前體化合物紫穗槐二烯 (圖3)。他們對該菌株進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：1) 途徑中代謝中間體的積累限制合成途徑通量的提升；2) 過表達(dá)MVA途徑中的酶會抑制大腸桿菌的生長[29]。通過LC/GC-MS和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析胞內(nèi)化合物含量后發(fā)現(xiàn)，HMG-CoA的積累導(dǎo)致大腸桿菌生長被抑制，這可能是由于HMG-CoA影響了脂肪酸的合成；此外細(xì)胞中某一基礎(chǔ)代謝中間體過度的消耗會競爭細(xì)胞生長的資源，同時(shí)也有可能引發(fā)細(xì)胞對過多外源蛋白產(chǎn)生壓力響應(yīng)機(jī)制[14]，正如Pitera等所發(fā)現(xiàn)的，MVA途徑的不平衡，導(dǎo)致中間體和副產(chǎn)物的積累，進(jìn)而抑制了途徑中酶的活力以及對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性，使得終產(chǎn)物難以高效率地合成，在他們的實(shí)驗(yàn)中，提高tHMGR的表達(dá)量即可解除HMG-CoA對細(xì)胞的毒性。2009年Jay D Keasling團(tuán)隊(duì)通過代謝通路分析、阻斷代謝旁路、消除有毒中間體積累、基因密碼子優(yōu)化和提高限速酶活力等手段，使MVA途徑的代謝流更為暢通，并將紫穗槐二烯的產(chǎn)量提高了7倍[12]。

圖2 β-丙氨酸生物合成途徑[33]

圖3 MVA或MEP途徑合成DMAPP及紫穗槐二烯[12]

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多新的調(diào)控手段被應(yīng)用于代謝工程改造。為了使細(xì)胞在不同時(shí)期更好地分配資源，以滿足生長與生產(chǎn)的需求，以傳感-調(diào)控系統(tǒng) (Sensor-regulator system) 為基礎(chǔ)的動態(tài)調(diào)控手段已被應(yīng)用于“細(xì)胞工廠”的構(gòu)建，該調(diào)控方式以代謝物響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子為基本的工具，可構(gòu)建一套自適應(yīng)和自主控制的系統(tǒng)，縮減成本同時(shí)提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量[38]。此外群感效應(yīng) (Quorum sensing, QS) 由于在微生物群體中廣泛存在，并且在調(diào)控群體生物學(xué)功能中有重要作用，也被應(yīng)用于代謝工程改造。2016年，Sun等對肺炎克雷伯氏菌響應(yīng)信號分子呋喃酰硼酸二酯 (Furanosyl borate diester, AI-2) 的群感響應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行了研究，該群感響應(yīng)系統(tǒng)在次級代謝產(chǎn)物積累方面扮演著重要角色。他們通過敲除基因以阻斷該群感響應(yīng)系統(tǒng)，降低了副產(chǎn)物羥基丁酮、乙醇和乙酸的含量，同時(shí)使2,3-丁二醇的產(chǎn)量提高了23.8%，達(dá)到了54.93 g/L[35]。

3 前體供應(yīng)

即便是合成途徑代謝流很通暢，有時(shí)目標(biāo)化學(xué)品的產(chǎn)量仍難以提升，這時(shí)需考慮化學(xué)品的合成前體是否得到了足量的供應(yīng)。與丙酮酸和Acetyl-CoA等容易從葡萄糖快速獲得的中間體不同，一些化合物合成中間體需要經(jīng)過特別的優(yōu)化才能得到足夠的供應(yīng)，例如聚酮和黃酮類化合物合成前體Malonyl-CoA，需要由Acetyl-CoA經(jīng)過CO2固定的羧化反應(yīng)獲得，在大腸桿菌胞內(nèi)Malonyl-CoA被維持在很低的水平[36]，對聚酮化合物的生物制造來講是一種障礙。Huimin Zhao實(shí)驗(yàn)室曾對大腸桿菌的Malonyl-CoA供應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)性地改造 (圖4)，研究人員首先過表達(dá)了Acetyl-CoA羧化酶基因，使Malonyl-CoA的胞內(nèi)含量提高了3倍，進(jìn)而敲除了、和基因，同時(shí)過表達(dá)了和基因，以增加Acetyl-CoA的供應(yīng)和削弱Malonyl-CoA代謝旁路，最終使得Malonyl- CoA的胞內(nèi)含量提高了15倍，這一系列的改造使間苯三酚的產(chǎn)量大幅度提升了4倍[40]。

化學(xué)品合成前體不僅需要足量的供應(yīng)，對于需要多個(gè)前體的合成途徑，不同前體需要協(xié)同供應(yīng)才能使途徑更順暢。B1a是阿維菌素中最為有效的組分，一分子B1a母核的合成需要以一分子的Methylbutanoyl-CoA (甲基丁酰CoA) 為起始單元，同時(shí)還需要5分子的Methylmalonyl-CoA (甲基丙二酸單酰CoA) 和7分子的Malonyl-CoA (丙二酸單酰CoA) 為延伸單元[19,39]，上述3種代謝中間體以1︰5︰7比例聚合成糖苷配基，進(jìn)而形成B1a母核。雖然至今尚未在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)阿維菌素的異源合成，但有許多工作已經(jīng)為其異源合成作了前體供應(yīng)的準(zhǔn)備。2017年Cui等嘗試在大腸桿菌中過表達(dá)來源于阿維鏈霉菌的支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合體，同時(shí)強(qiáng)化異亮氨酸的合成途徑，調(diào)整部分碳代謝通路 (圖5A)，以提供Methylbutanoyl- CoA、Malonyl-CoA和Methylmalonyl-CoA，得到的工程菌株Methylbutanoyl-CoA含量提升了632倍，Malonyl-CoA含量提升了13倍，Methylmalonyl-CoA含量提升了7.5倍，此外還能使大腸桿菌合成Isovaleryl-CoA，為阿維菌素及其他聚酮化合物的異源合成奠定了基礎(chǔ)。在此工程菌株的基礎(chǔ)上，他們構(gòu)建了同樣需要協(xié)同兩個(gè)前體的PIVP (3-甲基-異丁酰間苯三酚)合成途徑，一分子該化合物的合成需要一分子的Isovaleryl-CoA和3分子的Malonyl-CoA，優(yōu)化多種前體供應(yīng)可使PIVP產(chǎn)量大幅度提升了13.9倍 (圖5B)。

圖4 大腸桿菌中心代謝圖[40]

圖5 阿維菌素前體的協(xié)同合成途徑(A) 以及3-甲基-異丁酰間苯三酚產(chǎn)量[19] (B)

4 NAD(P)H等輔因子的再生與平衡

在化學(xué)品的生物制造中，理想的狀態(tài)是細(xì)胞工廠以最大的速率將碳流引向目標(biāo)化學(xué)品，且在此過程中包括還原力在內(nèi)的輔因子維持一個(gè)相對平衡的狀態(tài)。由于一條完整的代謝途徑往往伴隨著還原力的消耗或釋放，雖然維持胞內(nèi)還原力平衡是細(xì)胞的基本需求之一[18]，但在細(xì)胞工廠中，單純依賴細(xì)胞自身調(diào)節(jié)是很難維持這種平衡狀態(tài)的，需要人為地進(jìn)行干預(yù)。作為胞內(nèi)最重要的輔因子之一，F(xiàn)AD(H2)、NAD(P)+和NAD(P)H既可作為氧化反應(yīng)的電子受體，又可作為還原反應(yīng)的推動力，在細(xì)胞代謝中扮演者重要的角色。以釀酒酵母為例，胞內(nèi)NADH/NADPH含量是影響釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物的主要因素，Heux等將來源于乳酸乳球菌的NADH氧化酶 (生成水) 引入釀酒酵母，使NADH的胞內(nèi)濃度下降了5倍，NADH/NAD+的比率下降了6倍，結(jié)果使乙醇、甘油和丁二酸的產(chǎn)量急劇下降，相應(yīng)的具有更高氧化態(tài)的化合物如丁二酮、乙醛和乙酸有了更多的積累[16]。類似的例子還有乳酸菌的發(fā)酵，de Felipe等將NADH氧化酶引入乳酸乳桿菌后，菌株從單純的乳酸發(fā)酵變成了混合酸發(fā)酵，更有利于多種其他化學(xué)品的合成[25]。由此可見，細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)決定了碳代謝流的方向，對于有過多還原力釋放的代謝途徑，過表達(dá)NADH氧化酶是一種必然的選擇。

而對于合成途徑需要大量NADPH的途徑，需要加強(qiáng)NADH向NADPH轉(zhuǎn)換，2017年Qiao等構(gòu)建了13株解脂耶氏酵母，將糖酵解過程產(chǎn)生的NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH，用于脂肪酸甲酯的合成，最終使脂肪酸甲酯的生產(chǎn)強(qiáng)度提高至1.2 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.27 g脂肪酸甲酯/g葡萄糖，相比改造之前提高了25%[30]。同樣地，Liu等在大腸桿菌中通過敲除基因和加強(qiáng)，使脂肪酸β-氧化得到的NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH，使大腸桿菌用脂肪酸產(chǎn)3-羥基丙酸的產(chǎn)量提高至3.29 g/L，提高了55%[22]。

對于某些消耗還原力的代謝途徑，還原力再生與循環(huán)成為提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。自然界中存在許多厭氧發(fā)酵生物可將甘油還原為1,3-丙二醇，然而每合成1分子的1,3-丙二醇需要消耗1分子的NADH，在厭氧的生物催化中，只能通過將甘油降解至乙酸來提供還原力 (圖6A)，一方面產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，另一方面1,3-丙二醇的生產(chǎn)強(qiáng)度、效價(jià)和轉(zhuǎn)化率均存在瓶頸，再加上高昂的原料價(jià)格成本，這種生產(chǎn)方式并不具備市場競爭力[26]，因此有人提出外加葡萄糖補(bǔ)充還原力，但是在厭氧發(fā)酵條件下這種策略會進(jìn)一步增加副產(chǎn)物的生成。為了解決1,3-丙二醇發(fā)酵時(shí)所面臨的還原力困境，杜邦（DuPont）和杰能科（Genencor）在以葡萄糖為原料好氧條件下合成1,3-丙二醇方面進(jìn)行了大量的研發(fā)投入。研究人員首先對大腸桿菌進(jìn)行一系列的改造使50%的碳流向1,3-丙二醇的合成，剩余50%的碳流向TCA循環(huán) (圖6B1)，以提供更多的還原力。在好氧條件下，他們史無前例地以葡萄糖為碳源合成了高達(dá)130 g/L的1,3-丙二醇，遠(yuǎn)高于甘油轉(zhuǎn)化路線的78 g/L，在這種阻斷的前提下，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率達(dá)到了近40% (此途徑的理論轉(zhuǎn)化率為42.5%)，此后他們進(jìn)一步優(yōu)化了糖攝入方式，以便更有效地提供PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)，并且將部分流向TCA循環(huán)的碳引流至1,3-丙二醇和合成途徑，最終在10 L發(fā)酵罐中合成了135 g/L的1,3-丙二醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了51%[9]，成功實(shí)現(xiàn)了生物制造1,3-丙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)。在合成途徑中還原力供應(yīng)不足的情況下，可適量“燃燒”部分碳源來換取足量的還原力供給，以保證代謝通路的順暢。

在有些代謝途徑中，雖然從等式上來看還原力是不平衡的，但從還原力當(dāng)量上是平衡的，例如以L-苯基丙氨酸為原料生物催化合成L-苯基乙醇的途徑中，既有消耗α-酮戊二酸生成L-谷氨酸的反應(yīng)，又有消耗NADPH的反應(yīng)，Wang等將這兩步反應(yīng)偶聯(lián)起來，構(gòu)建了代謝途徑內(nèi)的輔因子自平衡系統(tǒng) (圖7)，使催化效率提高了3.8倍[37]。

除了上述NAD(P)H的再生影響代謝途徑的順暢進(jìn)行，諸如維生素B6 (各種轉(zhuǎn)氨酶依賴輔因子)、維生素B12 (甘油脫水酶依賴輔因子) 和生物素 (羧化酶依賴輔因子) 等輔因子對某些關(guān)鍵反應(yīng)步驟也有較大的影響，在代謝途徑限制靶點(diǎn)分析時(shí)應(yīng)給予重視。

圖6 以葡萄糖或甘油為原料合成1,3-丙二醇代謝途徑 (A：自然界中1,3-丙二醇合成途徑；B：代謝工程以葡萄糖為原料合成1,3-丙二醇[26])

圖7 輔因子自平衡轉(zhuǎn)化L-苯基丙氨酸合成2-苯基乙醇的代謝工程[37]

5 產(chǎn)物的反饋抑制與毒性

自然存在的代謝途徑普遍受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的抑制，因?yàn)樯镆S持胞內(nèi)各種化合物的相對穩(wěn)定，防止某一化合物的過度合成而消耗太多資 源[34]。例如在輔酶A合成途徑中泛酸激酶CoaA的活性受到胞內(nèi)CoA含量的調(diào)控，當(dāng)胞內(nèi)CoA含量升高時(shí)，泛酸激酶的活性幾乎完全喪失，以維持胞內(nèi)CoA含量的相對穩(wěn)定[31]。這種現(xiàn)象對生物制造來講是非常不利的，因?yàn)榧?xì)胞工廠的主要目的就是將原料盡可能地轉(zhuǎn)化為單一目標(biāo)化合物，因此在途徑設(shè)計(jì)、構(gòu)建與優(yōu)化的基礎(chǔ)上，為了得到較高的效價(jià)，需解除代謝途徑中的反饋抑制。一般來講，反饋抑制往往是終產(chǎn)物或代謝中間體對途徑中某個(gè)酶的酶活有抑制作用。對于抑制作用較弱的途徑，可通過不斷地分離終產(chǎn)物來解除抑制作用；而對于產(chǎn)物抑制作用很強(qiáng)的途徑，可通過酶的定向進(jìn)化與篩選來解除抑制，例如泛酸激酶CoaA的突變體F247V的酶活力幾乎完全不受CoA濃度的影響[31]。

氨基酸是一大類重要的生物制造目標(biāo)化學(xué)品，由于其代謝途徑通常受到嚴(yán)格的調(diào)控，在合成氨基酸的細(xì)胞工廠構(gòu)建過程中，調(diào)控是首先要解決的問題。比較典型的例子是蘇氨酸的生物合成，該途徑中不僅天冬氨酸激酶Ⅰ和Ⅲ分別受到蘇氨酸和賴氨酸的別構(gòu)抑制，此外蘇氨酸和異亮氨酸還能使操縱子衰減表達(dá)[23]。Lee等在大腸桿菌中對L-蘇氨酸合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)性地改造 (圖8)，它們首先解決了L-蘇氨酸反饋抑制的問題，通過在天冬氨酸激酶Ⅰ(ThrA)和Ⅲ (LysC) 中引入點(diǎn)突變，解除了氨基酸的別構(gòu)反饋抑制；將操縱子的啟動子更換為不受調(diào)控的啟動子，以解除該操縱子的衰減效果，同時(shí)提高途徑中酶的表達(dá)量；更進(jìn)一步地，他們過表達(dá)了蘇氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，盡可能降低了胞內(nèi)蘇氨酸的含量，以削弱反饋抑制的影響。最終他們可以利用葡萄糖合成82.4 g/L的蘇氨酸，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為0.393 g/g葡萄糖[21]。

除了代謝途徑終產(chǎn)物會產(chǎn)生反饋抑制，代謝中間體或者副產(chǎn)物有時(shí)也存在反饋抑制。前文中我們提到的以甘油為原料合成1,3-丙二醇的途徑中，往往伴隨著丙酮醛和甘油-3-磷酸的積累，這些化合物的積累一方面對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性，另一方面抑制了關(guān)鍵酶活力，Marie等分別阻斷了上述兩個(gè)副產(chǎn)物的合成途徑，使1,3-丙二醇的產(chǎn)量分別提升了50%和250%[41-42]。產(chǎn)物的反饋抑制與毒性問題的解決，對于構(gòu)建高效價(jià)化學(xué)品合成的細(xì)胞工廠來說尤為重要。

圖8 產(chǎn)蘇氨酸大腸桿菌代謝工程改造策略

6 總結(jié)與展望

高效率細(xì)胞工廠的構(gòu)建綜合了計(jì)量化學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬和生物技術(shù)等學(xué)科，尤其是當(dāng)前合成生物技術(shù)的發(fā)展，使改造生命體為人類服務(wù)成為可能。在細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)與組裝過程中，不僅需要通過計(jì)量化學(xué)來評估代謝途徑的可行性，還需要計(jì)算機(jī)模擬等工具優(yōu)化和設(shè)計(jì)更為高效的合成途徑以及合成元件，在此基礎(chǔ)上通過生物技術(shù)對合成模塊進(jìn)行組裝和微調(diào)，使代謝途徑中的前體得到充足的供應(yīng)、代謝流順暢、輔因子平衡和反饋抑制解除，進(jìn)而得到高效合成目標(biāo)化學(xué)品的細(xì)胞工廠 (圖9)。隨著合成生物技術(shù)的進(jìn)步，將會有許多表達(dá)元件與調(diào)控手段被開發(fā)，這些工具也將逐步被應(yīng)用于人工合成“細(xì)胞工廠”的構(gòu)建與 優(yōu)化。

圖9 生物制造“細(xì)胞工廠”的設(shè)計(jì)與組裝

[1] Beesch SC. Acetone-butanol fermentation of sugars. Ind Eng Chem, 1952, 44(7): 1677–1682.

[2] 1Gabriel CL. Butanol fermentation process. Ind Eng Chem, 1928, 20(10): 1063–1067.

[3] Caspi R, Foerster H, Fulcher CA, et al. MetaCyc: a multiorganism database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Res, 2006, 34(S1): D511–D516.

[4] Jang YS, Lee JY, Lee J, et al. Enhanced butanol production obtained by reinforcing the direct butanol-forming route in. mBio, 2012, 3(5): e00314–12.

[5] Jang YS, Woo HM, Im JA, et al. Metabolic engineering offor enhanced production of butyric acid. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(21): 9355–9363.

[6] Moon HG, Jang YS, Cho C, et al. One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol Lett, 2016, 363(3): fnw001.

[7] de Graef MR, Alexeeva S, Snoep JL, et al. The steady-state internal redox state (NADH/NAD) reflects the external redox state and is correlated with catabolic adaptation in. J Bacteriol, 1999, 181(8): 2351–2357.

[8] Dürre P. Fermentative butanol production: bulk chemical and biofuel. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1125(1): 353–362.

[9] Emptage M, Haynie SL, Laffend LA, et al. Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer: US, 6514733. 2003-02-04.

[10] Finley SD, Broadbelt LJ, Hatzimanikatis V. Computational framework for predictive biodegradation. Biotechnol Bioeng, 2009, 104(6): 1086–1097.

[11] Flamholz A, Noor E, Bar-Even A, et al. eQuilibrator—the biochemical thermodynamics calculator. Nucleic Acids Res, 2012, 40(D1): D770–D775.

[12] Anthony JR, Anthony LC, Nowroozi F, et al. Optimization of the mevalonate-based isoprenoid biosynthetic pathway infor production of the anti-malarial drug precursor amorpha-4,11-diene. Metab Eng, 2009, 11(1): 13–19.

[13] Hadadi N, Hafner J, Shajkofci A, et al. ATLAS of biochemistry: a repository of all possible biochemical reactions for synthetic biology and metabolic engineering studies. ACS Synth Biol, 2016, 5(10): 1155–1166.

[14] Harcum SW, Bentley WE. Heat-shock and stringent responses have overlapping protease activity in. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 80(1): 23–37.

[15] Henry CS, Broadbelt LJ, Hatzimanikatis V. Discovery and analysis of novel metabolic pathways for the biosynthesis of industrial chemicals: 3-hydroxypropanoate. Biotechnol Bioeng, 2010, 106(3): 462–473.

[16] Heux S, Cachon R, Dequin S. Cofactor engineering in: expression of a H2O-forming NADH oxidase and impact on redox metabolism. Metab Eng, 2006, 8(4): 303–314.

[17] Hou BK, Ellis LBM, Wackett LP. Encoding microbial metabolic logic: predicting biodegradation. J Ind Microbiol Biotechnol, 2004, 31(6): 261–272.

[18] Chen XL, Li SB, Liu LM. Engineering redox balance through cofactor systems. Trends Biotechnol, 2014, 32(6): 337–343.

[19] Cui QQ, Zhou FL, Liu WF, et al. Avermectin biosynthesis: stable functional expression of branched chain α-keto acid dehydrogenase complex frominby selectively regulating individual subunit gene expression. Biotechnol Lett, 2017, 39(10): 1567–1574.

[20] Kanehisa M, Goto S, Kawashima S, et al. The KEGG databases at GenomeNet. Nucleic Acids Res, 2002, 30(1): 42–46.

[21] Lee KH, Park JH, Kim TY, et al. Systems metabolic engineering offor L-threonine production. Mol Syst Biol, 2007, 3(1): 149.

[22] Liu B, Xiang SM, Zhao G, et al. Efficient production of 3-hydroxypropionate from fatty acids feedstock in. Metab Eng, 2019, 51: 121–130.

[23] Lynn SP, Gardner JF, Reznikoff WS. Attenuation regulation in the thr operon ofK-12: molecular cloning and transcription of the controlling region. J Bacteriol, 1982, 152(1): 363–371.

[24] Martin VJJ, Pitera DJ, Withers ST, et al. Engineering a mevalonate pathway infor production of terpenoids. Nat Biotechnol, 2003, 21(7): 796–802.

[25] Lopez de Felipe F, Kleerebezem M, de Vos WM, et al. Cofactor engineering: a novel approach to metabolic engineering inby controlled expression of NADH oxidase. J Bacteriol, 1998, 180(15): 3804–3808.

[26] Nakamura CE, Whited GM. Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol. Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(5): 454–459.

[27] Ogata H, Goto S, Sato K, et al. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res, 1999, 27(1): 29–34.

[28] Oh M, Yamada T, Hattori M, et al. Systematic analysis of enzyme-catalyzed reaction patterns and prediction of microbial biodegradation pathways. J Chem Inf Model, 2007, 47(4): 1702–1712.

[29] Pitera DJ, Paddon CJ, Newman JD, et al. Balancing a heterologous mevalonate pathway for improved isoprenoid production in. Metab Eng, 2007, 9(2): 193–207.

[30] Qiao KJ, Wasylenko TM, Zhou K, et al. Lipid production inis maximized by engineering cytosolic redox metabolism. Nat Biotechnol, 2017, 35(2): 173–177.

[31] Rock CO, Park HW, Jackowski S. Role of feedback regulation of pantothenate kinase (CoaA) in control of coenzyme A levels in. J Bacteriol, 2003, 185(11): 3410–3415.

[32] Schomburg I, Chang A, Hofmann O, et al. BRENDA: a resource for enzyme data and metabolic information. Trends Biochem Sci, 2002, 27(1): 54–56.

[33] Song CW, Lee J, Ko YS, et al. Metabolic engineering offor the production of 3-aminopropionic acid. Metab Eng, 2015, 30: 121–129.

[34] Stephanopoulos G, Vallino JJ. Network rigidity and metabolic engineering in metabolite overproduction. Science, 1991, 252(5013): 1675–1681.

[35] Sun SJ, Zhang HY, Lu SY, et al. The metabolic flux regulation ofbased on quorum sensing system. Sci Rep, 2016, 6: 38725.

[36] Takamura Y, Nomura G. Changes in the intracellular concentration of acetyl-CoA and malonyl-CoA in relation to the carbon and energy metabolism ofK12. Microbiology, 1988, 134(8): 2249–2253.

[37] Wang PC, Yang XW, Lin BX, et al. Cofactor self-sufficient whole-cell biocatalysts for the production of 2-phenylethanol. Metab Eng, 2017, 44: 143–149.

[38] Xu P. Production of chemicals using dynamic control of metabolic fluxes. Curr Opin Biotechnol, 2018, 53: 12–19.

[39] Yoon YJ, Kim ES, Hwang YS, et al. Avermectin: biochemical and molecular basis of its biosynthesis and regulation. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 63(6): 626–634.

[40] Zha WJ, Rubin-Pitel SB, Shao ZY, et al. Improving cellular malonyl-CoA level invia metabolic engineering. Metab Eng, 2009, 11(3): 192–198.

[41] Zhu MM, Lawman PD, Cameron DC. Improving 1,3-propanediol production from glycerol in a metabolically engineeredby reducing accumulation of-glycerol-3-phosphate. Biotechnol Prog, 2002, 18(4): 694–699.

[42] Zhu MM, Skraly FA, Cameron DC. Accumulation of methylglyoxal in anaerobically grownand its detoxification by expression of theglyoxalase I gene. Metab Eng, 2001, 3(3): 218–225.

Design and assembly of bio-manufacturing “cell factory”

Bo Liu, and Yong Tao

,,100101,

The chemical manufacturing industry that uses fossil resources as raw materials, consumes non-renewable resources and also causes damage to the ecological environment, stimulating the development of bio-manufacturing with renewable resources as raw materials. Unlike traditional chemical manufacturing, bio-manufacturing uses cells as a “production workshop”, and each process in the “workshop” is catalyzed by enzymes. In addition to mild reaction conditions, the “cell factory” has strong plasticity, and can be used to synthesize various target chemicals according to demand adjustment or reconstitution of metabolic pathways. The design process of the “cell factory” follows the following guidelines: 1) Construct an optimal synthetic route from raw materials to products; 2) Balance the metabolic flux of each reaction in the metabolic pathway, so that the metabolic flux of this pathway is much higher than the primary metabolism of the cells; 3) Precursor supply in the pathway should be sufficient, and adjust multiple precursors supply ratio as needed; 4) enzymatic reactions often involve the participation of various cofactors, smooth metabolic pathways need to balance or regenerate various cofactors; 5) Through genetic modification or process improvement to remove metabolic intermediates and products feedback inhibition to achieve higher yields.

bio-manufacturing, cell factory, design and assembly

10.13345/j.cjb.190270

陶勇 博士，博士生導(dǎo)師，研究員。1995年博士畢業(yè)于美國羅格斯大學(xué)；1995–1997年美國洛克菲勒大學(xué)Robert Roeder實(shí)驗(yàn)室博士后；1997–2010年任職于美國杜邦公司，資深研究員；2012–2015年中國科學(xué)院微生物研究所技術(shù)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化中心研發(fā)總監(jiān)；2015年至今，中國科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、研究員。擔(dān)任中國微生物學(xué)會酶工程專業(yè)委員會副主任，以及和等期刊編委。主要從事以代謝工程為基礎(chǔ)的新型生物催化劑開發(fā)與利用，在國際知名期刊、和等期刊發(fā)表文章60余篇，申請包括PCT在內(nèi)的專利70余項(xiàng)。

劉波, 陶勇. 生物制造“細(xì)胞工廠”的設(shè)計(jì)與組裝. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1942–1954.

Liu B, Tao Y. Design and assembly of bio-manufacturing “cell factory”. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1942–1954.

June22, 2019;

August 23, 2019

Supported by:The Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. ZDRW-ZS-2016-3-1).

Yong Tao. Tel/Fax: +86-10-64807419; E-mail: taoyong@im.ac.cn

中國科學(xué)院重點(diǎn)研究項(xiàng)目 (No. ZDRW-ZS-2016-3-1) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)