參枝苓口服液對App/Ps1雙轉(zhuǎn)基因小鼠早期海馬突觸和髓鞘改變的影響

鞏卓彥，黃帥陽，陳芳，盛寧，馮慧利，董云芳，任映，楊金鐸，王蓬文

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700)

目前的研究廣泛認為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種皮質(zhì)疾病，但AD發(fā)病中白質(zhì)的超微結構改變?nèi)缢枨屎蜕偻荒z質(zhì)細胞破壞會加速認知障礙[1]。AD患者體內(nèi)磁共振成像研究證實了AD中白質(zhì)受累的假設，發(fā)現(xiàn)了白質(zhì)微觀結構的改變。AD患者尸檢發(fā)現(xiàn)白質(zhì)總蛋白、髓鞘堿性蛋白、髓鞘蛋白脂蛋白，環(huán)核苷酸磷酸水解酶和膽固醇顯著降低，這表明髓鞘的丟失。髓鞘完整性受損也會導致神經(jīng)回路和認知功能的損害，髓鞘障礙引起的突觸功能破壞，會進一步影響神經(jīng)元回路，導致AD臨床癥狀的出現(xiàn)[2]。電子顯微鏡在澄清髓鞘精細結構方面發(fā)揮了重要作用[3]。β-淀粉樣蛋白(Amyloid-beta，Aβ)的聚集不僅會損傷改變髓鞘的完整性，也會影響成熟少突膠質(zhì)細胞的組織結構[4]。因此，觀察髓鞘和少突膠質(zhì)細胞的病理結構在AD中的變化具有重要意義。

參枝苓口服液作為我國第一個獲批用于輕、中度AD的中藥復方，在改善AD早期癥狀發(fā)揮著重要作用[5]。研究證明，參枝苓口服液可以通過增強扣帶回后部和大腦特定區(qū)域之間的互通性進而提高大腦功能，還能夠通過改善AD模型小鼠細胞內(nèi)Aβ的沉積和細胞外tau蛋白的高度磷酸化,從而提高其認知功能[6]。本研究通過觀察AD動物模型App/Ps1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘和突觸超微結構和突觸數(shù)量變化，探討參枝苓口服液對AD模型小鼠早期神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

3月齡SPF級雄性App/Ps1小鼠45只，以及同背景同月齡雄性C57BL/6J小鼠9只，體重在(20 ± 2)g，購自北京華阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2014-0004】，由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室【SYXK(京)2015-0001】進行飼養(yǎng)，實驗過程中動物單籠飼養(yǎng)、自由飲水和攝食。本實驗獲得北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(倫理號:15-26)。

1.1.2 試劑及儀器

鹽酸多奈哌齊由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司提供(批號140635)；參枝苓口服液(由人參，遠志，茯苓和石菖蒲共同組成)來自山東沃華藥業(yè)(國藥準字Z20120010)；神經(jīng)髓鞘固藍染色法(luxol fast blue)髓鞘染色液試劑盒(貨號G3240)由北京索萊寶科技有限公司提供；2.5%戊二醛溶液購自北京軍區(qū)陸軍總醫(yī)院八一腦科醫(yī)院電鏡室；氯化鈉、多聚甲醛、水合氯醛、二甲苯、無水乙醇(將100%乙醇和雙蒸水配制成95%乙醇、80%乙醇和70%乙醇)來自北京化學試劑公司；JEM-2100F型透射電鏡來自日本電子公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥

將45只3月齡App/Ps1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機等分成5組：模型組、多奈哌齊組0.92 mg/(kg·d)、參枝苓高劑量組50 g/(kg·d)、參枝苓中劑量組25 g/(kg·d)和參枝苓低劑量組12.5 g/(kg·d)，藥物均溶于蒸餾水中進行灌胃。9只同窩同月齡C57BL/6J雄性小鼠為對照組。適應性喂養(yǎng)3 d。給予模型組和對照組等體積的蒸餾水進行灌胃。連續(xù)3個月，1次/日。

1.2.2 小鼠腦組織取材

實驗灌胃結束后，將小鼠麻醉后固定于實驗臺，用手術剪充分暴露心臟和肝，灌注針插入心臟頂端并固定，同時從右心耳剪開一小口并注射0.9%氯化鈉溶液至肝變白，繼續(xù)推注4%多聚甲醛固定液以充分灌注直至小鼠全身僵硬停止。固定后隨即斷頭剪開顱骨，暴露腦組織，置于冰上快速取出海馬CA1區(qū)，儲存于盛有2.5%戊二醛溶液的EP管內(nèi)，4℃靜置2 h充分固定后用PBS緩沖液沖洗3次。

1.2.3 透射電鏡觀察

對海馬組織進行常規(guī)制備超薄切片，采用透射電鏡在1500倍的視野下隨機取5個視野計算突觸數(shù)量并比較其平均值，在2000倍的視野下觀察每組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的超微結構，在4000倍數(shù)的視野下觀察每組小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘的超微結構，分析其形態(tài)學變化。

1.2.4 Luxol fast blue髓鞘染色(伊紅法)

將用4%多聚甲醛固定后的腦組織進行冠狀面后部取材、脫水、透明、石蠟包埋。包埋結束后對每組海馬組織進行連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，然后對切片進行l(wèi)uxol fast blue髓鞘染色(伊紅法)。

在60℃恒溫烤箱中對制好的石蠟切片進行烤片，1 h后立即放入二甲苯Ι中脫蠟20 min，再依次放入二甲苯ΙΙ中20 min、100%乙醇3 min、95%乙醇3 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，最后在雙蒸水中沖洗。將清洗好的切片放入95%乙醇蘸洗，隨后將切片置于luxol fast blue髓鞘染色劑中，室溫過夜后于第2天取出切片依次用95%乙醇、雙蒸水沖洗殘余染色液。將切片依次用luxol分化液分色15 s、70%乙醇分色30 s，用光學顯微鏡下觀察灰白質(zhì)直至清晰，放置于雙蒸水中。用伊紅染液將分化好的切片復染2 min，隨后放入蒸餾水中進行沖洗，用光學顯微鏡觀察。觀察結束后依次用無水乙醇5 min、95%乙醇5 min脫水，先后放入二甲苯Ι和二甲苯ΙΙ中分別透明20 min、中性樹膠封片。晾干后用光學顯微鏡觀察腦髓鞘的分布形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 透射電鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量的變化

電鏡×1.5 k倍視野下觀察神經(jīng)氈中的突觸數(shù)目，計算隨機選擇的5個神經(jīng)氈視野中的突觸數(shù)量并比較其平均值。與對照組相比，模型組小鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目顯著減少(P< 0.01)；各給藥組突觸數(shù)目均多于模型組(P< 0.01)。(圖1)。

注：A. 神經(jīng)氈(標尺=2.0 μm)；B. 突觸數(shù)量。圖1 各組小鼠海馬組織種的突觸結構Note. A. Nerve felts (Bar=2.0 μm). B. Number of synapses.Figure 1 Ultrastructural images of synapses in the mouse hypocampus

2.2 透射電鏡觀察App/Ps1小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘等相關超微結構的形態(tài)學變化

電鏡×4.0 k倍數(shù)下顯示對照組髓鞘結構較為完整(圖2a)，模型組髓鞘結構發(fā)生顯著破壞(圖2b)；與模型組相比，各藥物組髓鞘結構均有不同程度改善(圖2c-f)。電鏡×2.0 k倍數(shù)下觀察對照組少突膠質(zhì)細胞結構基本完整、核膜較連續(xù)、核染色質(zhì)分布較均勻(圖3a)；模型組的少突膠質(zhì)細胞內(nèi)核染色質(zhì)固縮，呈凋亡前狀態(tài)，(圖3b)；與模型組相比，各給藥組的少突膠質(zhì)細胞結構明顯好轉(zhuǎn)，核染色質(zhì)分布均勻(圖3c-f)。電鏡×1.5 k倍數(shù)下顯示對照組神經(jīng)元結構完整，染色質(zhì)均勻分布，核形態(tài)正常，胞質(zhì)結構正常(圖4a)；模型組神經(jīng)元呈凋亡早期改變，核染色質(zhì)固縮，胞質(zhì)內(nèi)可見解聚的多聚核糖體、線粒體腫脹，部分線粒體出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，整個細胞發(fā)生退行性改變(圖4b)；與模型組比較，多奈哌齊組神經(jīng)元結構基本正常，參枝苓各劑量組神經(jīng)元結構均有改善，形態(tài)完整，核染色質(zhì)分布較均勻，多聚核糖體和線粒體較豐富(圖4c-f)。

圖2 各組小鼠髓鞘超微結構(標尺=1.0 μm)Figure 2 Ultrastructure of myelin sheath in each group (Bar=1.0 μm)

圖3 各組小鼠少突膠質(zhì)細胞超微結構(標尺=2.0 μm)Figure 3 Ultrastructure of oligodendrocytes in the mouse hippocampus CA1 area of each group (Bar=2.0 μm)

2.3 Luxol fast blue髓鞘染色(伊紅法)觀察小鼠海馬髓鞘變化

髓鞘經(jīng)luxol fast blue特殊染色后，白質(zhì)纖維呈深藍色，對照組髓鞘出現(xiàn)密集分布的深藍色白質(zhì)纖維(圖5a,圖6a)；模型組白質(zhì)纖維明顯減少且染色變淡，顯示髓鞘減少(圖5b,圖6b)；較模型組，多奈哌齊組和參枝苓各劑量組小鼠腦內(nèi)髓鞘白質(zhì)纖維分布顯著增加且染色變深(圖5c-f,圖6c-f)。

3 討論

圖4 各組小鼠神經(jīng)元超微結構(標尺=2.0 μm)Figure 4 Ultrastructure of neurons in the mouse hippocampus CA1 area of each group (Bar=2.0 μm)

圖5 各組小鼠Luxol fast blue髓鞘染色(標尺=500 μm)Figiure 5 Changes of myelin sheath in the mouse brain tissues of each group (Luxol fast blue staining. Bar=500 μm)

圖6 各組小鼠Luxol fast blue髓鞘染色 (Bar=200 μm)Figiure 6 Changes of myelin sheath in the mouse brain tissues of each group (Luxol fast blue staining. Bar=200 μm)

研究發(fā)現(xiàn)先于軸突異常發(fā)生的髓鞘損傷與AD緊密相關。髓鞘破壞是指軸突周圍髓鞘的損傷和丟失，并早于老年斑沉積和神經(jīng)纖維纏結發(fā)生[7]。早在1964年就有研究人員利用電子顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)在AD患者白質(zhì)中存在廣泛的脫髓鞘病變，發(fā)現(xiàn)髓鞘板層之間有空間較大且充滿致密的顆粒狀碎片和空泡[8],而目前的研究針對AD具體髓鞘變化知之甚少。研究顯示，少突膠質(zhì)細胞在AD進展期間表現(xiàn)出特定的形態(tài)學變化，通過原位缺口末端標記的方法發(fā)現(xiàn)Aβ通常會導致少突膠質(zhì)細胞破裂和細胞體收縮[9]。各種觀察結果表明，髓鞘和少突膠質(zhì)細胞受損可能會加速認知障礙。但目前針對AD病理變化中髓鞘及少突膠質(zhì)細胞超微結構變化鮮有報道。突觸功能異常也會引發(fā)各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]，突觸丟失和神經(jīng)元破壞也是造成AD早期記憶損傷的重要原因[11]。課題組前期對App/Ps1小鼠突觸的超微結構進行了研究，發(fā)現(xiàn)參枝苓口服液能改善突觸結構[12]，可能會進一步改變突觸可塑性，從而增強其早期空間記憶能力和記憶保持能力[13]。

目前尚無有效方法能夠治愈AD，西藥針對AD的某一環(huán)節(jié)有阻斷作用，中醫(yī)藥由于其整體觀和辨證論治的特點及優(yōu)勢越來越受到研究者的青睞。參枝苓口服液以開心散為基礎進行遣藥組方，從心論治。方中黨參補氣安神，桂枝溫經(jīng)振陽，茯苓益氣凝神，遠志、石菖蒲、龍骨和牡蠣能夠通竅安神，炙甘草和干姜健脾和中。針對AD本虛標實的病機本質(zhì)，一則補益心氣、振奮心陽，二則行氣化痰開竅[14]。

本實驗利用透射電鏡研究參枝苓口服液對App/Ps1小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘、少突膠質(zhì)細胞、突觸和神經(jīng)元超微結構的影響。結果顯示，模型組App/Ps1小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘板層結構發(fā)生顯著損壞、少突膠質(zhì)細胞呈凋亡前狀態(tài)、突觸數(shù)目減少、神經(jīng)元出現(xiàn)退行性改變；Luxol fast blue 染色顯示髓鞘纖維明顯減少，染色變淺。與模型組相比，參枝苓各劑量組App/Ps1小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘板層結構均明顯好轉(zhuǎn)、少突膠質(zhì)細胞結構有所改善且染色分布均勻，突觸數(shù)目增多，神經(jīng)元結構呈現(xiàn)不同程度的改善；Luxol fast blue染色顯示髓鞘纖維分布顯著增加且染色加深。以上結果都表明，參枝苓口服液可能是通過改善小鼠海馬CA1區(qū)髓鞘、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的形態(tài)學變化，以及增加突觸數(shù)目從而影響突觸功能來發(fā)揮早期AD患者的神經(jīng)保護作用。