基于NLRP3炎性體軸和NF-κB信號通路探討加味三妙丸防治痛風性關節(jié)炎的作用及機制

浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053

近年來，隨著人們生活水平提高，高蛋白、高嘌呤等食物攝入增多，加上飲酒、焦慮、疲勞等因素，使得體內尿酸濃度呈不斷升高趨勢，尿酸鹽結晶沉積在關節(jié)處，最終引起痛風性關節(jié)炎（gouty arthritis，GA）[1]。GA具有反復發(fā)作、疼痛劇烈等特點，尤其是急性期所致的關節(jié)疼痛及關節(jié)破壞，給患者日常生活帶來了很大障礙[2]。

研究表明，在痛風發(fā)展的病理過程中，除代謝因素外，炎癥與免疫機制也參與發(fā)病[3]。Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎性體軸和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路是誘發(fā)痛風性關節(jié)炎的重要通路，該兩條通路的激活最終會導致白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥因子的大量釋放，是引起痛風急性發(fā)作的關鍵因素[4-7]。因此，以NLRP3炎性體軸和NF-κB信號通路為切入點，開發(fā)治療GA的新藥具有重要意義。

目前臨床上使用的抗GA藥物（秋水仙堿、非甾體類抗炎藥物等），存在白細胞減少、再生障礙性貧血、肝損害等不良反應，不適宜長期服用。而中藥在GA的治療方面具有一定優(yōu)勢，近年來隨著現代中醫(yī)藥的發(fā)展，研究已證實有很多自擬方，或者以經方、成方為基礎進行加減的中藥方劑治療GA效果良好[8-10]。本研究在經典方三妙丸基礎上，配伍除濕、解毒、通利關節(jié)的土茯苓（Smilax glabra Roxb.），組成加味三妙丸（modified Sanmiao pill，MSMP），探討其 GA 的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人源單核白血病細胞株THP-1由中科院上海細胞庫提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購于美國Gibco公司(批號：1914970)；β-巰基乙醇、MTT 購于美國 Amresco公司（批號：M0482100、1755C459）；雙抗、RPMI 1640 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphote buffered saline，PBS）購于美國Hyclone公司（批號：J170027、AD23107271、AC11223329）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購于北京Solarbio公司（批號：818E0312）；秋水仙堿購于上海阿拉丁公司（批號：G1514018）；尿酸鈉（monosodium urate，MSU）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，PMA） 購于美國 Sigma-Aldrich 公司（批號：BC8R7559、SLBS0478V）；人 IL-1β ELISA檢測試劑盒購于美國Thermo Fisher公司（批號：165998051）；髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、NF-κB p65、磷酸化 NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）、NF-κB 抑制蛋白 α(inhibitor of NF-κB α，IκBα）、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）、磷酸化 IκB 激酶 α（phospho-inhibitor of NF-κB kinase α，p-IKKα）、NLRP3抗體均購于Cell Signaling Technology公司（批號：3、16、10、18、19、9、3）；抗 Toll樣受體 2（Tolllike receptor 2，TLR2）、抗 TLR4、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、抗含CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）抗體均購于abcam公司（批號：GR3182784-1、GR308811-8、GR202191-1、2813878）。

1.1.3 主要儀器 Power Blotter XL半干轉膜儀、HH-2細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo Fisher公司；Synergy H1型多功能微孔板檢測儀、Mini-PROTEAN Tetra System垂直電泳儀購于美國BioTek公司；5427R型低溫離心機購于德國Eppendorf公司；Odyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)購于美國LICOR公司；數顯恒溫水浴鍋購于常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備 土茯苓、黃柏、蒼術、川牛膝購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，鑒定后按照本課題組方法自制，其中土茯苓：黃柏：蒼術：川牛膝=3:3:2:1，提取物符合指紋圖譜質控要求[11]。精密稱取MSMP凍干粉1g，以10mL含10%體積分數二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的PBS超聲溶解，濃度為100mg·mL-1，作為保存液，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，分裝，-20℃避光保存。臨用前以培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 細胞培養(yǎng) THP-1細胞采用含10%胎牛血清、0.05mmol·L-1β-巰基乙醇及 1%雙抗的 RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d傳代1次。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率 將THP-1細胞以5×104/mL的數量接種于96孔板中，每孔加入50ng·mL-1PMA，誘導24h使細胞貼壁，PBS洗滌后，在預試驗的基礎上，加入0.05～1.0mg·mL-1系列濃度的MSMP，分別作用12h或24h后棄去上清液，每孔加入200μL MTT溶液，培養(yǎng)4h后棄去，每孔加150μL DMSO，以空白孔調零，充分震蕩，490nm處檢測吸光度，計算各組細胞存活率。

1.2.4 實驗分組與給藥 將細胞分為空白組、模型組、秋水仙堿組和MSMP低、中、高劑量組。將THP-1細胞以5×105/mL的數量接種于6孔板中，每孔加入50ng·mL-1PMA，誘導24h使細胞貼壁，以PBS洗滌，除空白組外其余各組用1μg·mL-1LPS刺激24h，經PBS洗滌兩次后，分別加入0.1μmol·L-1秋水仙堿和0.1、0.2、0.4mg·mL-1MSMP，然后分別加入 MSU，使終濃度為10mg·mL-1，刺激3h。收集各組細胞上清液或細胞裂解液，用于各項指標測定。

1.2.5 ELISA檢測THP-1細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平 取細胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β水平。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白表達 取細胞裂解液，BCA試劑盒進行蛋白定量。每泳道上樣蛋白20μg，SDS-PAGE電泳后，電轉至PVDF膜，加入一抗，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次5min，加入二抗，孵育2h后，TBST洗滌3次，每次5min，以Odyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)采集信息并攝取圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度MSMP對細胞存活率影響 實驗結果顯示MSMP對細胞存活率無明顯影響，說明毒性較小、作用溫和。給藥處理24h后，MSMP劑量在0.05～0.4mg·mL-1時，細胞存活率均大于90%。見表1。因此以0.1、0.2、0.4 mg·mL-1作為后續(xù)實驗中MSMP的劑量。

2.2 各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較 與空白組比較，模型組IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，MSMP低、中、高劑量組IL-1β水平均顯著降低（P＜0.01），且具有劑量依賴性。見圖1。

表1 不同濃度MSMP對細胞存活率的影響（±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of MSMP on cell viability(±s，%)

表1 不同濃度MSMP對細胞存活率的影響（±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of MSMP on cell viability(±s，%)

MSMP 濃度（mg·mL-1） 12h 24h 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0 100 99.72±0.23 99.73±0.27 97.60±0.13 97.41±0.05 96.46±0.12 94.71±0.03 100 93.12±0.06 93.31±0.12 93.14±0.07 92.88±0.03 86.42±0.11 80.38±0.09

圖1 各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較Fig.1 Comparison of level of IL-1β of culture supernatant in each group

2.3 各組細胞 MyD88、TLR2、TLR4蛋白表達比較與空白組比較，模型組MyD88、TLR2和TLR4蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，MSMP中、高劑量組MyD88、TLR2和TLR4蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；MSMP 低劑量組 TLR2、TLR4的蛋白表達低于模型組（P＜0.05），MyD88蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 2。

圖2 各組細胞MyD88、TLR2、TLR4蛋白表達比較Fig.2 Comparison of expression of MyD88,TLR2 and TLR4 protein in each group

2.4 各組細胞NF-κB炎癥信號通路磷酸化蛋白表達比較 與空白組比較，模型組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，MSMP 中、高劑量組 p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα 蛋白顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；MSMP 低劑量組p-NF-κB p65和p-IKKα蛋白表達降低（P＜0.01，P＜0.05），p-IκBα 蛋白表達無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.5 各組細胞NLRP3炎性體軸蛋白表達比較 與空白組比較，模型組NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，MSMP低、中、高劑量組NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 4。

3 討論

圖3 各組細胞NF-κB炎癥信號通路磷酸化蛋白表達比較Fig.3 Comparison of expression of phosphorylated proteins of NF-κB signaling pathway in each group

中醫(yī)學認為痛風屬“痹癥”范疇，最主要的病因是“濁瘀痹”，即脾腎虧虛、濕濁、痰濁及瘀血，產生的代謝產物積聚于關節(jié)、軟組織及軟骨，從而引發(fā)體內一系列炎癥反應[12]。因此，治療痛風的關鍵在于清熱祛濕、活血化瘀、疏通經絡、調補脾腎等。根據中醫(yī)治療原則，本課題組研發(fā)了MSMP，方中土茯苓、黃柏為君，解毒除濕、通利關節(jié)；蒼術為臣，燥濕健脾；川牛膝為使，逐瘀通經，全方符合中醫(yī)治療GA的治則?，F代藥理學研究也發(fā)現，土茯苓、黃柏等藥物中黃酮類與生物堿類化合物具有良好的抗痛風、抗炎作用[13-16]。

圖4 各組細胞NLRP3炎性體軸相關蛋白表達比較Fig.4 Comparison of expression of NLRP3 inflammasome axis protein in each group

GA發(fā)病過程中伴隨著諸多信號通路的激活或抑制，其中NLRP3炎性體軸在許多急性和慢性炎癥中處于中心地位[17]，MSU結晶被吞噬進入細胞時，細胞質中的NLRP3炎性復合體同時被激活。除上述激活途徑外，內源性損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs） 也能促進 NLRP3炎性體、ASC與caspase-1前體相互作用，促使caspase-1前體從復合物中裂解，形成具有活性的caspase-1[18]。隨后，活化的caspase-1促進IL-1β生成并釋放到細胞外，IL-1β的異常分泌導致機體產生炎癥反應，或者加重原有的炎癥反應[19]。本研究發(fā)現，MSMP能明顯下調NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達，降低IL-1β水平，這表明MSMP能通過下調NLRP3炎性體軸相關蛋白及caspase-1的表達，從而抑制IL-1β釋放，防止GA急性發(fā)作。

研究表明，MSU作為DAMPs能夠被細胞表面及細胞內的病原識別受體（如TLR2、TLR4等）識別，MyD88可為TLRs傳遞信號，在MSU誘導的免疫反應中，MyD88是必不可少的轉接蛋白[20]。TLRs與病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）結合后，與MyD88的羧基末端相互作用，使MyD88活化。此外，在GA等炎癥模型中，NF-κB對炎性因子的釋放起到關鍵作用。當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB二聚體在細胞質中與IκBα結合而以無活性狀態(tài)存在，受到刺激后，IκBα開始被IKKα磷酸化，而后迅速降解，釋放活化的p-NF-κB，后者進入細胞核內與DNA結合，啟動靶基因轉錄，刺激機體產生、釋放白細胞介素-1β前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）[21-24]。本研究結果表明，在 THP-1 細胞中，MyD88活化后能夠激活NF-κB，進而促進pro-IL-1β釋放。MSMP能明顯抑制IL-1β相關受體激酶的活化，從而下調TLR2、TLR4及NF-κB炎癥信號通路相關蛋白的表達，減少pro-IL-1β釋放，而且該機制與對NLRP3炎性體軸的抑制形成協同效應，進一步抑制IL-1β的產生，從而發(fā)揮抗GA的作用。

綜上所述，本研究證實MSMP通過抑制NLRP3炎性體軸和NF-κB信號通路，從而協同抑制IL-1β等炎性因子釋放，是其治療GA的重要分子機制。