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    紅景天苷通過調(diào)節(jié)miR-30d-5p表達減弱大鼠心肌細胞肥大的機制研究

    2019-10-31 08:23:18余平
    浙江中醫(yī)藥大學學報 2019年10期
    關(guān)鍵詞:紅景天熒光素酶心肌細胞

    余平

    1.浙江省立同德醫(yī)院 杭州 310012 2.浙江中醫(yī)藥大學藥學院

    心力衰竭的前期通常伴隨著心臟肥大的過程,心肌肥厚和心室容量減少是心臟肥大的兩個主要標志,左心室心肌肥厚往往繼發(fā)于高血壓引起的心臟負荷增加,患者最終可發(fā)生心力衰竭[1]。近年來,心力衰竭發(fā)病率和死亡率升高的趨勢日益明顯,提高該病的防治水平勢在必行。相對于化學藥物不良反應大的弊端,天然藥物治療心力衰竭往往從抗氧化、改善微循環(huán)、擴張冠脈、增加血流量等多方面同時發(fā)揮作用[2-3],在治療心力衰竭方面具有廣闊的應用前景。

    紅景天是一種傳統(tǒng)中藥,臨床上廣泛用于治療包括心力衰竭在內(nèi)的多種心血管疾病。紅景天苷(salidroside,SAL)是紅景天最有效的活性成分之一,臨床上廣泛用于各種疾病的治療[4]。SAL作用機制多樣,能夠通過增加蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB/Akt)的磷酸化,降低半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的活化來抑制心肌細胞凋亡[5];還能夠通過增加缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達水平,減輕缺氧誘導的心肌細胞壞死和凋亡,并通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/Akt通路,減輕心肌缺血再灌注損傷[6-7];SAL能夠通過調(diào)節(jié)過氧化物酶增殖物活化受體γ輔助活化因子-1α(peroxisome proliferators-activiated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)-核呼吸因子 1(nuclear respiratory factor1,NRF1)/核呼吸因子 2(nuclear respiratory factor2,NRF2)通路改善心肌線粒體呼吸功能,并通過增加細胞質(zhì)中VEGF和CD34的mRNA和蛋白水平來促進心肌損傷后的血管生成[8-9]。

    微小RNA(microRNA,miR)是一類內(nèi)源性小RNA分子,能夠通過抑制翻譯或引發(fā)mRNA靶標的降解來抑制蛋白質(zhì)合成[10]。研究已證實,miR與心肌肥厚和心力衰竭的病理過程相關(guān)[11]。課題組前期篩選出了一系列改善心肌肥厚的中藥單體,其中就包括SAL。然而,SAL是否可以通過調(diào)節(jié)心肌細胞的miR表達,改善心肌肥厚仍不清楚。本研究擬觀察SAL對大鼠肥大心肌細胞中的miR表達的影響,并進一步研究對下游基因的作用。

    1 材料和方法

    1.1 主要試劑 Trizol、lipofectamine2000均購于Invitrogen 公司(批號:20171115、20171210);雙熒光素酶psiCheck2報告質(zhì)粒購于Promega公司(批號:0009015);雙熒光素酶報告基因測定試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于Thermo Fisher公司(批號:00501250、00300820);全蛋白提取試劑盒購于Keygen公司(批號:T025413);BCA 蛋白定量試劑盒、D-Hanks液均購于 Solarbio公司(批號:B8733、D5127);miScript ⅡRT Kit購于 QIAGEN 公司(批號:216415);miRcute miRNA qPCR Detection Kit購于SYBR Green公司(批號:20170110);iScript cDNA synthesis kit購于BIO-RAD 公司(批號:1708890);5-溴-2-脫氧尿苷(5-Bromouracil deoxyriboside,BrdU)、苯腎上腺素(phenylephrine,PE)、抗 actin抗體均購于 Sigma公司(批號:201181、202527、301137);抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)抗體、抗三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體均購于Abcam公司(批號:3495-1、2887-1);免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Alexa Fluor 647為碧云天公司產(chǎn)品(批號:P0191);紅景天苷購于北京世紀奧科生物科技有限公司(純度≥98%,分子式:C14H2O7,分子量:300.3,批號:160920)。

    1.2 儀器 低溫離心機購于Eppendorf公司;定量PCR儀7900 HT Sequence Detection System為ABI公司產(chǎn)品;FV1000激光共聚焦顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)購于BIO-RAD公司。

    1.3 方法

    1.3.1 心肌肥大細胞模型建立 1~3日齡SD大鼠由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。在37℃培養(yǎng)箱中以0.2%胰蛋白酶消化分離的新生大鼠心室肌細胞,離心后,以(3~5)×105的細胞密度培養(yǎng)于含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。接種24h后除去血清,以100μmol·L-1PE誘導細胞。將心肌肥大細胞模型隨機分為兩組:SAL組和模型組,SAL組以10μL·mL-1SAL處理48h,另外將正常原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞作為正常對照組。

    1.3.2 心肌細胞免疫熒光染色和細胞表面積分析取無菌蓋玻片置于24孔板內(nèi),將心肌細胞接種于蓋玻片上,在4%多聚甲醛中固定15min,以含0.1%Triton X-100的PBS透化,含5%PBS的脫脂奶粉封閉1h,再加入1:500稀釋后的actin抗體溫育過夜并以PBS洗滌3次,與二抗共孵育,PBS洗滌后安裝載玻片,激光共聚焦顯微鏡下拍攝圖像,以AxioVision 4.7.1(Carl Zeiss)軟件分析細胞表面積。

    1.3.3 miR微陣列分析 miR微陣列實驗和分析由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。使用Trizol試劑提取3組心肌細胞總RNA,每組設有3個復孔,通過miR微陣列(Chip ID miRRat 11.0 version,LC Sciences,Houston,TX,USA)進行分析。減去背景分析數(shù)據(jù),使用LOWESS濾波器將信號標準化為局部回歸加權(quán)。使用3個生物學重復的平均值作為miR的表達水平,并通過Student's t檢驗進行3組間的比較。

    1.3.4 miR靶基因預測 經(jīng)基因芯片篩選出模型組和SAL組中表達差異的miR,在符合要求的兩種miR中,miR-30d-5p表達差異度高于miR-199a-5p,因此選擇miR-30d-5p作為研究對象。數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址:TargetScan(http://www.targetscan.org),MiRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和 MirWalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk)。

    1.3.5 熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及熒光素酶活性分析 通過NCBI網(wǎng)站查獲miR的基因組序列,Primer 3設計含Xho1和Not1酶切位點的PCR引物,左側(cè)Xho1 引物:5'-ctcgagCGGAGCAGAGCCATGGGCACGTCTTCAG-3',右側(cè) Not1 引物:5'-gcggccgcCCTATTGCTGGATGCTTTCCAAGTCCC-3'。按以下反應體系擴增 miR前體:2×Ex Taq 5μL、左側(cè)引物0.2μL、右側(cè)引物 0.2μL、DNA 3μL,ddH2O 1.6μL;反應條件如下:95℃ 15s,55℃ 15s,72℃ 20s,共 25 個循環(huán)。用Xho1和Not1消化PCR產(chǎn)物,長度為387bp,對含有miR-30d-5p結(jié)合位點的GRP78 3’-UTR片段進行PCR擴增,引物序列:上游引物5'-GGAGTGGGTCAATTCTGTTGTCA-3';下游引物5'-CCCGGCACTAACGTCATTC-3'。通過Real-time PCR擴增GRP78-3'UTR片段,并與psiCheck2質(zhì)粒-Report連接,以構(gòu)建psiCheck2質(zhì)粒GRP78 3'-UTR熒光素酶報告基因載體。以合成螢火蟲熒光素酶基因作為轉(zhuǎn)染對照,lipofectamine2000轉(zhuǎn)染,用含有GRP78 3'-UTR miRNA轉(zhuǎn)染的psiCheck2載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,孵育24h后在發(fā)光計上檢測熒光素酶活性,以陰性對照RNA作為對照。

    1.3.6 Real-time PCR檢測miR-30d-5p和GRP78 mRNA水平 心肌細胞總RNA的提取同前。miR-30d-5p引物序列:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACG-AACAG-3’。GRP78引物序列:上游引物5'-GGAGTGGGTCAATTCTGTTGTCA-3’;下游引物5'-CCCGGCACTAACGTCATTC-3’。逆轉(zhuǎn)錄反應條件 25℃ 5min,42℃ 30min,85℃ 5min;PCR過程按qPCR試劑盒說明書在熒光定量PCR儀上進行。PCR反應條件:95℃5min,95℃ 10s,60℃ 30s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照,獲得Ct值后,應用比較Ct法進行相對定量,目標基因的相對表達量按2-ΔΔCt計算。

    1.3.7 心肌細胞轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)同1.3.1。lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染,按照指示miR最終濃度為400ng/孔。轉(zhuǎn)染24h后,將原始培養(yǎng)基替換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基。將細胞分為6組:陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照RNA的正常心肌細胞)、PE+陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照RNA的PE誘導后心肌細胞)、miR-30d-5p模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物的PE誘導后心肌細胞)、miR-30d-5p抑制物組(轉(zhuǎn)染miR-30d-5p抑制物的PE誘導后心肌細胞)、miR-30d-5p模擬物+SAL組(轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物的PE誘導后心肌細胞,并以SAL 10μL·mL-1處理)和miR-30d-5p抑制物+SAL組(轉(zhuǎn)染miR-30d-5p抑制物的PE誘導后心肌細胞,并以SAL 10μL·mL-1處理)。轉(zhuǎn)染24h后,更換培養(yǎng)基,繼續(xù)以含有新鮮胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。

    1.3.8 Western blot檢測蛋白表達 以蛋白提取試劑盒提取各組心肌細胞總蛋白,測定總蛋白濃度后,加入上樣緩沖液煮沸3min變性,經(jīng)SDS/PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂奶粉封閉后分別與1:1 000稀釋的一抗(抗GRP78抗體和抗GAPDH)4℃孵育過夜,與1:5 000稀釋的相應二抗在室溫下孵育2h,ECL化學發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,對結(jié)果進行灰度掃描分析。

    1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料均采用±s表示,兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組心肌細胞表面積比較 心肌細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,PE處理后心肌細胞發(fā)生肥大,與正常對照組比較,模型組細胞表面積增大約31%(P<0.01);與模型組比較,SAL組心肌細胞表面積減小約15.3%(P<0.01)。見圖 1。

    2.2 microRNA微陣列分析 與正常對照組比較,模型組中14種miR表達差異明顯,其中5種上調(diào)、9種下調(diào);與模型組比較,SAL組中10種miR表達差異明顯,其中7種上調(diào)、3種下調(diào)。模型組miR-30d-5p表達量顯著低于正常對照組和SAL組(P<0.01),而SAL組miR-30d-5p表達量與正常對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖 2。說明 miR-30d-5p下調(diào)可能是導致心肌肥大的機制之一,而SAL能夠抑制miR-30d-5p下調(diào)。

    圖1 心肌細胞免疫熒光染色結(jié)果Fig.1 Myocardial immunofluorescence staining results

    圖2 miR微陣列分析結(jié)果Fig.2 MiR microarray analysis results

    2.3 生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因測定結(jié)果 生物信息學方法確定miR-30d-5p的潛在靶基因為GRP78,在GRP78 mRNA的3'-UTR中進行miR-30d-5p一個結(jié)合位點的鑒定,見圖3A。PE誘導后,與正常對照組比較,模型組中miR-30d-5p水平降低 0.4倍(P<0.05);與模型組比較,SAL組中 miR-30d-5p表達增加了0.4倍(P<0.05)。見圖3B。Realtime PCR檢測發(fā)現(xiàn),與正常對照組比較,模型組GRP78 mRNA 表達顯著增加 (P<0.05);SAL 組GRP78 mRNA 表達低于模型組(P<0.05),但與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3C。采用雙熒光素酶報告基因測定驗證miR-30d-5p和GRP78之間的關(guān)系,提示與陰性對照組比較,與GRP78 3'-UTR融合的熒光素酶報告基因表達被miR-30d-5p模擬物抑制了31%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3D。證實 miR-30d-5p通過其 3'抑制GRP78表達。Western blot結(jié)果也顯示,miR-30d-5p組GRP78表達下調(diào),而抗miR-30d-5p組GRP78表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3E、3F。上述結(jié)果表明,miR-30d-5p可直接靶向調(diào)節(jié)GRP78的表達。

    圖3 生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因測定結(jié)果Fig.3 Results of bioinformatics method and dual luciferase reporter gene assay

    與陰性對照組比較,轉(zhuǎn)染miR-30d-5p模擬物后miR-30d-5p的表達水平顯著增加(P<0.01)。見圖4A。Real-time PCR分析結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,分別用miR-30d-5p模擬物或miR-30d-5p抑制物轉(zhuǎn)染48h后,再用10μL·mL-1的SAL處理心肌細胞,miR-30d-5p的表達水平分別增加3.3倍和3.14倍(P<0.01)。見圖4B。GRP78 mRNA水平分別下調(diào)了 55%和 53%(P<0.01)。見圖 4C。

    圖4 miR-30d-5p模擬物或miR-30d-5p抑制物轉(zhuǎn)染48h結(jié)果Fig.4 Results of miR-30d-5p mimics or miR-30d-5p inhibitor transfection for 48h

    2.4 各組GRP78蛋白表達比較 與正常對照組比較,模型組GRP78蛋白表達顯著增高(P<0.01);與模型組比較,SAL組GRP78蛋白表達顯著降低(P<0.01),SAL和正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5A、B。心肌肥大細胞模型經(jīng)miR-30d-5p模擬物轉(zhuǎn)染后,GRP78蛋白表達顯著下降(P<0.01);經(jīng)miR-30d-5p抑制物轉(zhuǎn)染后,GRP78蛋白表達顯著增加(P<0.01)。SAL處理后,與PE+陰性對照組比較,GRP78蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見圖 5C、D。

    3 討論

    SAL是中藥紅景天最有效的活性成分之一,化學名為對羥基苯乙基-β-D葡萄糖苷,其苷元為對羥基苯乙醇。SAL主要來源于紅景天屬、越桔屬、杜鵑花屬、女貞屬等多種植物,為無色透明針狀結(jié)晶[12]。研究證實,SAL具有心臟保護、抗疲勞、抗壓力、抗抑郁、抗焦慮、提高神經(jīng)功能及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種功效[13]。

    miR是長度為20~24個核苷酸的非編碼RNA家族[11]。本實驗首次從miR的角度系統(tǒng)性研究了SAL在調(diào)節(jié)心肌細胞肥大中的作用機制。結(jié)果表明,PE誘導的心肌細胞肥大與兩類不同的miR改變有關(guān),這兩類miR對心肌細胞具有相反的表型效應。本研究的結(jié)果為SAL調(diào)節(jié)肥大心肌細胞中的miR表達提供了明確證據(jù)。其中,最顯著的變化是模型組中的miR-30d-5p表達下調(diào),而SAL可以抑制這種下調(diào)。通過生物信息學算法、雙熒光素酶報告基因檢測和Real-time PCR鑒定明確miR-30d-5p的靶基因為GRP78。

    圖5 各組GRP78蛋白表達比較Fig.5 Comparison of the expression of GRP78 protein in each group

    心臟是一種高度塑化的器官,隨著生理或病理需求的變化而擴大或收縮。當心室肥大時,心臟會擴張,收縮功能下降,因而導致心衰[14]。心臟肥大是心肌細胞對各種刺激的補償反應,主要病理變化是心肌細胞體積增大和心肌細胞蛋白質(zhì)合成增加[15-16]。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immuno-globulin heavy chain binding protein,Bip),屬于熱休克蛋白 70 家族的一員,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的分子伴侶[17]。GRP78分子及其DNA序列結(jié)構(gòu)在許多生物物種中高度保守[18]。GRP78參與阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生肽聚集、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡,以及啟動未折疊蛋白反應等細胞生命過程[19]。既往研究證實,GRP78參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)過程與心肌肥大相關(guān)[20-21]。本研究結(jié)果提示,模型組中GRP78的蛋白表達顯著增加,GRP78是miR-30d-5p的靶基因,miR-30d-5p上調(diào)可以抑制心肌細胞中GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達,miR-30d-5p下調(diào)則可以促進GRP78的表達,提示GRP78介導的ERS信號低表達可能是心肌細胞肥大的原因,而SAL可以逆轉(zhuǎn)這一過程。

    綜上所述,本研究初步證實miR-30d-5p具有抑制心肌肥大的作用,SAL可能通過增加心肌細胞中miR-30d-5p的表達,降低GRP78 mRNA及蛋白表達,從而改善心肌肥大。該研究結(jié)果有助于更好地了解SAL在心肌細胞肥大治療中的潛在機制。

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