青蒿組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

王佳興 許婷婷 嵇景雙 宗憲春

摘要? ? 本文從外植體的選擇與處理、培養(yǎng)條件和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及配比方面綜述了影響青蒿組織培養(yǎng)的因素，并從外植體污染、褐變及玻璃化等方面分析了青蒿組織培養(yǎng)中存在的問題及對(duì)策，以期為青蒿組織培養(yǎng)快速繁殖提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞? ? 青蒿;組織培養(yǎng);影響因素;問題;對(duì)策

中圖分類號(hào)? ? S567.219? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）17-0069-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? This paper reviewed the influencing factors of tissue culture of Artemisia annua L.，from the aspects of the selection and treatment of explants，culture conditions，the types and proportions of plant growth regulators.The problems and countermeasures in the tissue culture of Artemisia annua were analyzed from the aspects of contamination，browning and vitrification of the explants，so as to provide scientific basis for the rapid propagation of Artemisia annua.

Key words? ? Artemisia annua L.;tissue culture;influence factor;problem;countermeasure

青蒿（Artemisia annua L.）別名黃花蒿，是雙子葉植物綱桔梗目菊科一年生草本植物。其莖高100～200 cm，根單生，葉紙質(zhì)，多分枝;頭狀花序、形狀為球形，總苞片層數(shù)為3～4層，兩性花，數(shù)量為10～30朵，花顏色為深黃色;果實(shí)橢圓狀卵形，略扁，瘦果小;花果期8—11月。作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，青蒿的作用有很多，主要作用是清熱、涼血、化斑、消暑、瀉熱、消腫、止汗等;從中提取的青蒿素具有減慢心率、抑制心肌收縮力、抗心律失常、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，對(duì)治療瘧疾也有著良好的療效，并且低毒無副作用[1]。屠呦呦及其團(tuán)隊(duì)受到中醫(yī)典籍《肘后備急方》的啟發(fā)，在對(duì)中藥進(jìn)行大量研究的基礎(chǔ)上創(chuàng)建了青蒿素提取方法，青蒿抗瘧活性化學(xué)部位在1971年10月被發(fā)現(xiàn)，青蒿素在1972年11月被發(fā)現(xiàn)。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了青蒿素，屠呦呦獲得了2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，2016年又獲得了國(guó)家最高科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)[2]。中國(guó)是世界上青蒿素原料藥最大、質(zhì)量最好的國(guó)家，僅重慶市酉陽地區(qū)的青蒿產(chǎn)量就約占全球產(chǎn)量的80%[3]。

大量、快速獲取青蒿素含量高且穩(wěn)定的青蒿的最好方法就是采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快繁，這也是提高青蒿素產(chǎn)量的有效途徑之一。本文從外植體的選擇與處理、青蒿的器官培養(yǎng)途徑和組織培養(yǎng)中存在的問題對(duì)青蒿組織培養(yǎng)進(jìn)行了概述，旨在為青蒿植物的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1? ? 影響青蒿植物組織培養(yǎng)的因素

1.1? ? 外植體

1.1.1? ? 外植體的選擇。在植物組織培養(yǎng)研究中，外植體的選擇是首要條件，若外植體取材方便、取材期長(zhǎng)，那么在短期內(nèi)就能得到大量再生植株，對(duì)迅速建立起無菌系進(jìn)而達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)也有著極大的幫助。目前，用于青蒿組織培養(yǎng)的外植體有莖段、葉片、頂芽、花蕾、花枝和花序等部位。黃紅芳等[1]曾用青蒿的莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)，認(rèn)為青蒿莖段為理想的外植體。王夢(mèng)瓊[4]用青蒿的花枝、花序和葉片作為外植體進(jìn)行研究，得出了“愈傷組織的生成能力順序?yàn)榛ㄖ?花序>葉片，植株再生以花枝的培養(yǎng)結(jié)果最佳”的結(jié)論。張麗珍等[3]用青蒿的幼葉作為外植體進(jìn)行組培快繁試驗(yàn)，結(jié)果表明，青蒿的幼葉也可誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到87%。

1.1.2? ? 外植體的滅菌。在接種之前必須對(duì)材料進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌消毒，否則植物組織培養(yǎng)無法順利進(jìn)行。滅菌消毒遵循的基本原則：要?dú)⑺栏街诓牧媳砻娴奈⑸?，同時(shí)還要保證材料不失去活性。要特別注意消毒時(shí)間，材料的不同決定了時(shí)間的不同。黃紅芳等[1]在處理青蒿莖尖時(shí)，先用自來水沖洗30 min，然后用蒸餾水沖洗，再用吸水紙吸干表面水分后浸泡在濃度為75%的酒精中10 s，之后轉(zhuǎn)入濃度為0.1%和0.2%的HgCl2溶液中浸泡10 min，其間攪拌2～3次，最后于超凈工作臺(tái)中用無菌水沖洗莖段3～4次。張麗珍等[3]在對(duì)青蒿頂芽進(jìn)行處理時(shí)，將頂芽沖洗干凈后放入超凈工作臺(tái)，用濃度為75%的酒精消毒30 s，再用濃度為0.1%的HgCl2消毒10 min，最后用無菌水沖洗頂芽3～5次。穆勝玉[5]在處理青蒿的花序時(shí)，先將花序放入濃度為10%的NaClO溶液中消毒15 min，然后用無菌水沖洗花序5次。李? 飛等[6]在處理青蒿葉片與葉柄時(shí)，先將葉片和葉柄放在自來水下沖洗20 min，然后置于超凈工作臺(tái)上，用濃度為70%的酒精消毒10 s、0.1%升汞消毒8 min，之后用蒸餾水沖洗葉片和葉柄4～5次，最后用滅過菌的濾紙吸干葉片和葉柄表面的水分。王夢(mèng)瓊[4，7]在對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行處理時(shí)，先用濃度為70%的酒精浸泡1 min，再用濃度為5%的NaClO消毒10 min。劉春朝[8]在處理不同的外植體時(shí)用的方法不同，處理青蒿枝條時(shí)，先將枝條放在濃度為70%的酒精中消毒30 s，再用濃度為0.1%的升汞加入2滴吐溫-80消毒7 min，最后用無菌水沖洗6遍;處理青蒿葉片和花蕾時(shí)，先用濃度為70%的酒精消毒30 s，然后用濃度為0.1%的升汞消毒5 min，最后用無菌水沖洗6～8次。綜上所述，青蒿外植體滅菌過程相對(duì)簡(jiǎn)單，但分化率很高。

1.2? ? 培養(yǎng)條件

溫度、光照時(shí)間和光照強(qiáng)度等因素均對(duì)青蒿組織培養(yǎng)的效果有一定影響。一般來說，青蒿適宜的培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃[3，5-6，8-9]或（25±2）℃[1，6]、光照12 h·d-1[1，6，8]或14 h·d-1[3]或16 h·d-1[5，9]、光照強(qiáng)度1 500 lx[1]或2 000 lx[3，5-6，9]。研究表明，外植體在培養(yǎng)初期，尤其是在誘導(dǎo)愈傷組織階段，黑暗條件或弱光條件下培養(yǎng)效果較強(qiáng)光條件下更好[10]。王夢(mèng)瓊等[4，7]在誘導(dǎo)青蒿愈傷組織時(shí)，將材料放置在24～28 ℃條件下避光培養(yǎng)9 d。

1.3? ? 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

1.3.1? ? 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)青蒿愈傷組織誘導(dǎo)的影響。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、濃度及其配比對(duì)青蒿愈傷組織誘導(dǎo)率具有一定影響。黃紅芳等[1]用6-BA和IBA誘導(dǎo)青蒿莖段愈傷組織，在6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到100%。張麗珍等[3]用相同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)青蒿葉片愈傷組織，在6-BA 0.5 mg/L+IBA 2.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率為60%。王夢(mèng)瓊[4]用6-BA和2，4-D誘導(dǎo)青蒿花枝與花序的愈傷組織，在6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到100%。劉春朝[8]用6-BA和NAA誘導(dǎo)青蒿花蕾愈傷組織時(shí)，在6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率僅有46.4%。穆勝玉等[9]用NAA和2，4-D誘導(dǎo)青蒿花序愈傷組織時(shí)，在NAA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率僅為5.56%。

1.3.2? ? 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)青蒿無菌苗生根培養(yǎng)的影響。張麗珍等[3]取2～3 cm高的青蒿再生苗接種至加入不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基中觀察根的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青蒿再生苗的生根誘導(dǎo)與激素濃度關(guān)系不大，不添加任何激素或者濃度較低的IBA也能誘導(dǎo)不定根的發(fā)生;最適合青蒿無菌苗生根誘導(dǎo)的IBA濃度為0.5 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)到93%。穆勝玉[5]在MS培養(yǎng)基中添加IAA和NAA進(jìn)行青蒿生根培養(yǎng)試驗(yàn)，20 d后得出結(jié)論：對(duì)青蒿試管苗生根影響較大的是NAA的濃度，濃度越大，生根率越高，且根也明顯增長(zhǎng)、增粗;而IAA對(duì)于青蒿試管苗生根影響不明顯，且IAA濃度增大生根率反而降低。李? 飛等[6]將分化的叢生苗分別接種于1/2MS+1.0 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L NAA、MS+0.1 mg/L NAA等3種生根培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)青蒿幼苗在1/2MS+1.0 mg/L NAA生根培養(yǎng)基上根長(zhǎng)得最長(zhǎng)、最快，并且根粗壯且密，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯高于其他2個(gè)生根培養(yǎng)基。劉春朝[8]將不同外植體誘導(dǎo)的叢生芽接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果表明，NAA和IBA即使?jié)舛鹊停簿艹晒Φ卣T導(dǎo)叢生芽生根，生根率可達(dá)到80%以上。

2? ? 移栽

組培苗根長(zhǎng)1～2 cm時(shí)即可進(jìn)行馴化移栽。移栽前先要進(jìn)行開瓶煉苗，煉苗結(jié)束后將根上的培養(yǎng)基清洗干凈，然后移栽至基質(zhì)中。在移栽初期，為了使小苗適應(yīng)外界的環(huán)境，應(yīng)提供充足的光照和適宜的空氣濕度;在移栽后期，注意勿過旱或過澇。李? 飛等[6]將已經(jīng)生根的青蒿閉光煉苗5～7 d后栽種到珍珠巖和草木灰按2∶1的比例配制的基質(zhì)中，移栽成活率可達(dá)到90%。劉春朝[8]將根長(zhǎng)5 cm左右的幼苗在培養(yǎng)室中打開瓶口煉苗3～5 d后移栽于蛭石和營(yíng)養(yǎng)土比例為1∶1的混合基質(zhì)中，成活率達(dá)到90%以上。

3? ? 青蒿組織培養(yǎng)中存在的問題及對(duì)策

3.1? ? 外植體污染及其防治

污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中，由于細(xì)菌、真菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)容器中滋生出大量的菌斑，導(dǎo)致培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育的現(xiàn)象[11]。外植體污染的形式有很多種，主要分為真菌污染和細(xì)菌污染。真菌污染是由霉菌和酵母菌引起的，特點(diǎn)是易于發(fā)現(xiàn)，但是污染速度快、控制困難，一旦發(fā)生真菌污染則損失較大;細(xì)菌污染是由各種細(xì)菌及內(nèi)生菌引起的，特點(diǎn)是潛伏期較長(zhǎng)，有時(shí)繼代幾次后才能夠表現(xiàn)出來[12]。污染的原因多種多樣，如外植體帶入、培養(yǎng)基高壓滅菌不到位、培養(yǎng)室滅菌不徹底、操作污染等;在后期培養(yǎng)過程中，由于人員經(jīng)常出入，也會(huì)造成污染發(fā)生?？刂仆庵搀w污染的措施包括組培室消毒、外植體消毒、對(duì)真菌的控制、對(duì)細(xì)菌的控制等。

3.2? ? 褐變及其防治

褐變是指在離體繁殖過程中培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色由無色變?yōu)楹稚?，培養(yǎng)材料也隨之死亡的現(xiàn)象[13]。褐變?cè)谥参锝M織培養(yǎng)過程中很常見，主要起決定作用的是植物多酚氧化酶（PPO）。一般情況下，若氧氣存在于培養(yǎng)基中，酚類化合物就能在PPO的催化作用下轉(zhuǎn)化為醌，醌再進(jìn)行聚合反應(yīng)形成黑色素，從而導(dǎo)致褐變的發(fā)生[14]。賈秀山等[15]認(rèn)為，對(duì)于青蒿葉片和莖段誘導(dǎo)而言，葉片誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的褐變較少，莖段誘導(dǎo)分化培養(yǎng)褐化較嚴(yán)重，可能是因?yàn)槿~片誘導(dǎo)愈傷組織的PPO活性較低。PPO的活性和總酚含量的變化規(guī)律決定了外植體褐變的變化規(guī)律，起決定性作用的是酚類物質(zhì)的含量?？刂坪肿儸F(xiàn)象的措施包括合理取材、母株和外植體預(yù)處理、選擇合適的培養(yǎng)基和外植體的連續(xù)轉(zhuǎn)移等。

3.3? ? 玻璃化及其防治

玻璃化是植物組織培養(yǎng)中一種獨(dú)特的生理現(xiàn)象，是由于培養(yǎng)環(huán)境中一些物理、化學(xué)和生化因素共同作用，導(dǎo)致植物組織代謝紊亂所致。有玻璃化現(xiàn)象的植株也被稱為“玻璃苗”，其往往呈半透明狀，如同玻璃。玻璃苗在青蒿組織培養(yǎng)過程中非常常見。玻璃苗由于生理功能不同于正常苗，所以很難移栽成活。影響玻璃苗發(fā)生的因素有很多，如外植體的類型、培養(yǎng)基的種類與濃度、激素的質(zhì)量濃度及配比、瓊脂的濃度、蔗糖的濃度以及溫度、光照等[16]。解決青蒿組培苗的玻璃化現(xiàn)象不能只采取一種處理方式。張麗珍等[17]發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA、4%蔗糖、0.75%瓊脂和0.08%碳粉，能夠使增殖系數(shù)增高、玻璃化率降低。劉春朝[8]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，頂芽和莖段等外植體誘導(dǎo)出的叢生芽玻璃化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，在頂芽和莖段的培養(yǎng)中，防止玻璃化現(xiàn)象發(fā)生的最好方法是增加培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，在MS培養(yǎng)基中附加50 g/L的蔗糖或9 g/L的瓊脂能有效防止組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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