實(shí)時(shí)定量PCR在先天性小瞼裂綜合征患者FOXL2基因檢測(cè)中的應(yīng)用

陳麗娟 王中英 李思佳 胡姍姍

[摘要]目的 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)鑒定先天性小瞼裂綜合征（BPES）患者中FOXL2基因的突變和（或）缺失。方法 于2017年8月收集黑龍江省1個(gè)BPES患病家系，采集外周血提取基因組DNA，用PCR直接測(cè)序法和實(shí)時(shí)定量PCR法篩查FOXL2基因的全部外顯子。結(jié)果 在此例患病家系中，用PCR直接測(cè)序法排除了基因內(nèi)突變，用實(shí)時(shí)定量PCR方法確定了FOXL2基因全缺失。這些變異在未患病親屬和50名正常人中并未被檢測(cè)到。結(jié)論 本研究是應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)BPES患者FOXL2基因缺失的報(bào)道，這項(xiàng)技術(shù)豐富了BPES患者的分子遺傳學(xué)診斷方法。

[關(guān)鍵詞]小瞼裂綜合征;叉頭蛋白L2;實(shí)時(shí)定量PCR;缺失;突變

[中圖分類(lèi)號(hào)] R777.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）8（b）-0079-04

[Abstract] Objective To identify the mutation or deletion of the FOXL2 gene in patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome （BPES） using quantitative real-time PCR technology. Methods A family with BPES was collected in Heilongjiang Province in August 2017. Genomic DNA extracted from peripheral blood was collected from the family. PCR direct sequencing and quantitative real-time PCR sequencing for the whole exon of the FOXL2 gene were performed. Results In this family， deletion of the FOXL2 gene was confirmed by the quantitative real-time PCR technique， which intragenic mutations were excluded by PCR direct sequencing. This change was not detected either in the non-carrier relatives or in 50 normal controls. Conclusion This is the study to report FOXL2 gene deletion detected by quantitative real-time PCR in Chinese BPES patients. This technique enriches the diagnostic methods of molecular genetics in BPES patients.

[Key words] Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome; Forkhead box protein L2; Quantitative real-time PCR; Deletion; Mutation

小瞼裂綜合征（BPES）是一種罕見(jiàn)的遺傳疾病，以眼瞼畸形和卵巢功能不全為特征。依據(jù)是否伴有卵巢功能衰竭（POF），本病分為兩種臨床亞型，Ⅰ型患病女性同時(shí)患有POF;Ⅱ型則與POF無(wú)關(guān)[1-2]。BPES主要以常染色體顯性方式遺傳，偶有散發(fā)病例和常染色體隱性遺傳方式報(bào)道[3]。經(jīng)細(xì)胞重組和連鎖分析研究后，BPES可能致病基因被定位于人類(lèi)染色體3q23上[4]。隨后，F(xiàn)OXL2（forkhead box protein L2）基因被確定為BPES的致病基因。此外，非綜合征性POF和卵巢粒細(xì)胞瘤也相繼報(bào)道與FOXL2的基因突變相關(guān)[5-6]。

迄今為止，已報(bào)道的與BPES患者相關(guān)的FOXL2基因突變有200余個(gè)。在所有已發(fā)現(xiàn)的遺傳缺陷中，約有80%的病例是由于FOXL2基因內(nèi)部突變所致[7];約2%的病例與細(xì)胞染色體的重排相關(guān)，包括染色體不平衡易位和3號(hào)染色體的中間缺失[8];約12%的病例是源于部分或全部的FOXL2基因長(zhǎng)缺失和（或）其鄰近的基因缺失[9];還有5%的病例是由于FOXL2的調(diào)控基因缺失[10]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，可應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增（MPLA）技術(shù)[11]檢測(cè)FOXL2基因單倍體缺失來(lái)證實(shí)常染色體顯性遺傳方式的BPES家系是源于FOXL2基因長(zhǎng)缺失。本研究應(yīng)用PCR直接測(cè)序法和實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)1個(gè)患有BPES中國(guó)家系進(jìn)行FOXL2基因的突變及長(zhǎng)缺失篩查。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

于2017年8月收集黑龍江省1個(gè)BPES患病家系（F1）。本研究經(jīng)過(guò)牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循赫爾辛基宣言，在知情同意的情況下，對(duì)家系中2位患者（先證者及其母親）及1位有血緣關(guān)系的正常家系成員（先證者父親）進(jìn)行病史采集。對(duì)其家系患病情況進(jìn)行系譜分析（3代9名成員，其中患有BPES者3名，未患病成員6名）。同時(shí)選取同期在我院體檢中心進(jìn)行健康檢查的50名正常人，臨床診斷由婦科和生殖科醫(yī)師協(xié)診，眼科醫(yī)師確診，排除其他眼部及系統(tǒng)疾病，且經(jīng)由患者家屬同意獲取眼部照片。

1.2 PCR測(cè)序分析

血樣采自BPES患者及正常家系成員，并且儲(chǔ)存在-20℃的環(huán)境里。使用血液基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini kit，Qiagen，Hilden，Germany）抽提基因組DNA。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法對(duì)FOXL2基因整個(gè)外顯子（包括編碼區(qū)和側(cè)翼序列）DNA序列測(cè)定進(jìn)行突變分析，引物序列如表1所示。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR分析

實(shí)時(shí)定量PCR的引物由TakaRa生物工程公司設(shè)計(jì)、合成（引物序列如表2所示）。兩對(duì)引物的擴(kuò)增片段分別位于FOXL2基因的5′和3′端。實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系按SYBR Green PCR Master Mix（TakaRa生物工程公司提供）試劑盒制備，應(yīng)用7000實(shí)時(shí)定量PCR儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。將位于21號(hào)染色體上的C2基因作為目標(biāo)序列的量化模板。以正常對(duì)照組DNA作為校對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)測(cè)得的相對(duì)循環(huán)周期閾值（Ct）來(lái)計(jì)算樣本的相對(duì)拷貝數(shù)（RCN）[12]。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，以排除人為誤差?；蜷L(zhǎng)缺失的判定點(diǎn)為A≈0.5倍RCN的異常。

2結(jié)果

2.1臨床表現(xiàn)

本次研究中的先證者（F1-Ⅲ∶3，圖1）為女童，有典型的BPES特征，即瞼裂狹小、上瞼下垂、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮和內(nèi)眥距離過(guò)寬。但POF需成人后確診。其母親患有BPES，在兒童期已接受過(guò)眼瞼矯正術(shù)，目前未患POF。該家系未能確定BPES臨床分型。

2.2 PCR測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)FOXL2基因的直接測(cè)序，排除了家系中的基因內(nèi)突變。

2.3實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證患者是否存在FOXL2基因的長(zhǎng)缺失。研究顯示，患者的RCN約為健康個(gè)體的一半（圖2）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到的產(chǎn)物拷貝數(shù)異常（CNVs）即意味著FOXL2基因的長(zhǎng)缺失，缺失的長(zhǎng)度為兩組引物之間的全部FOXL2基因長(zhǎng)度（chr 140148003-140146289）。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，以消除操作誤差。正如實(shí)驗(yàn)設(shè)想所示，在BPES家系未患病親屬和50名正常人中均未檢測(cè)到FOXL2基因的長(zhǎng)缺失。實(shí)時(shí)定量PCR的兩對(duì)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物表明家系患者的基因拷貝數(shù)約為未患病親屬的一半。

3討論

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在BPES家系（F1）中檢測(cè)到了FOXL2基因的長(zhǎng)缺失。與熒光原位雜交（FISH）技術(shù)和MLPA技術(shù)相比，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)更為方便、快捷。本研究中分別位于FOXL2基因5′端和3′端的兩對(duì)引物相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增片段的拷貝數(shù)均接近于健康個(gè)體的50%（圖2），這就意味著這兩對(duì)引物之間的區(qū)域缺失，即FOXL2基因長(zhǎng)缺失。據(jù)報(bào)道，約12%的BPES病例是源于部分或全部的FOXL2基因長(zhǎng)缺失和（或）其鄰近的基因缺失，因而缺失篩查應(yīng)常規(guī)應(yīng)用于BPES的分子診斷領(lǐng)域。Beysen等[10]認(rèn)為BPES患者FOXL2基因長(zhǎng)缺失與POF的發(fā)生無(wú)相關(guān)性，而D′haene等[11]的研究表示，F(xiàn)OXL2的基因缺失可能與卵巢功能不全的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究試圖在此家系中評(píng)估BPES的分型，家系1中患病女童處于青春期前的發(fā)展階段，其母親未表現(xiàn)出不孕或是患有POF，意味著FOXL2基因的長(zhǎng)缺失未影響其在卵巢中的表達(dá)，所以BPES的分型不能被確定。FOXL2基因缺失引起的單倍劑量不足可能影響卵巢功能，導(dǎo)致女孩在以后的某時(shí)期患POF。因此，除了眼科的隨診，未確定的表型的年輕女性患者需要密切的內(nèi)分泌和婦產(chǎn)科的隨診。本研究是通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)中國(guó)患者FOXL2基因缺失，所以可以確定實(shí)時(shí)定量PCR可以作為FOXL2的基因缺失篩查的可靠、方便、廉價(jià)的分子診斷工具，這能使得BPES患者的基因咨詢(xún)工作更加便利，并且能夠幫助擴(kuò)展女性患者對(duì)于POF的臨床隨診。

以往的研究顯示，F(xiàn)OXL2基因內(nèi)突變產(chǎn)生的截短蛋白質(zhì)會(huì)大量的聚集在細(xì)胞核內(nèi)[13]，這些異常定位和聚集影響FOXL2核內(nèi)定位，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害它自身的DNA綁定功能，進(jìn)而影響其與其它蛋白質(zhì)的相互作用。研究顯示，F(xiàn)OXL2突變后轉(zhuǎn)錄功能的降低不僅與蛋白的異常聚集有關(guān)，而且與氨基酸側(cè)鏈的位置是否朝向螺旋結(jié)構(gòu)的疏水核密切相關(guān)[14]。也有學(xué)者認(rèn)為FOXL2突變受到上下游其他基因的協(xié)同控制而發(fā)揮作用，影響靶基因的調(diào)節(jié)[15]，從而導(dǎo)致BPES發(fā)生。本研究中的FOXL2基因缺陷引起單倍體劑量不足，導(dǎo)致無(wú)效等位基因的產(chǎn)生，并可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物的失效，產(chǎn)生無(wú)意義的衰變[16]。由于FOXL2基因羧基末端的完整多聚丙氨酸長(zhǎng)鏈對(duì)StAR基因（生成類(lèi)固醇急性調(diào)控因子基因）的轉(zhuǎn)錄有抑制作用[17]，因而FOXL2基因缺失或是失去多聚丙氨酸長(zhǎng)鏈的基因突變可以增強(qiáng)StAR的表達(dá)，繼而導(dǎo)致BPES和POF的發(fā)生，成為BPES的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，本研究是通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)中國(guó)人檢測(cè)FOXL2基因缺失，為將實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)作為相對(duì)可靠的、便利的和廉價(jià)的方法應(yīng)用于檢測(cè)BPES患者遺傳學(xué)缺陷提供理論支持。該技術(shù)的應(yīng)用不僅促進(jìn)了BPES的遺傳學(xué)診斷發(fā)展，還為患病家系的遺傳學(xué)咨詢(xún)提供了依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Gulati R，Verdin H，Halanaik D，et al.Co-occurrence of congenital hydronephrosis and FOXL2-associated blepharophimosis，ptosis，epicanthus inversus syndrome （BPES）[J].Eur J Med Genet，2014，57（10）：576-578.

[2]Nuovo S，Passeri M，Di Benedetto E，et al.Characterization of endocrine features and genotype-phenotypes correlations in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome type 1[J].J Endocrinol Invest，2016，39（2）：227-233.

[3]Chawla B，Bhadange Y，Dada R，et al.Clinical，radiologic，and genetic features in blepharophimosis，ptosis，epicanthus inversus syndrome in the Indian population[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54（4）：2985-2991.

[4]Crisponi L，Deiana M，Loi A，et al.The putative forkhead transcription factor FOXL2 is mutated in blepharophimosis/ptosis/epicanthus inversus syndrome[J].Nat Genet，2001，27（2）：159-166.

[5]Yang XW，He WB，Gong F，et al.Novel FOXL2 mutations cause blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome with premature ovarian insufficiency[J].Mol Genet Genomic Med，2018，6（2）：261-267.

[6]Leung DT，F(xiàn)uller PJ，Chu S.Impact of FOXL2 mutations on signaling in ovarian granulosa cell tumors[J].Int J Biochem Cell Biol，2016，72：51-54.

[7]Yang L，Li T，Xing Y.Identification of a novel FOXL2 mutation in a single family with both types of blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mol Med Rep，2017， 16（4）：5529-5532.

[8]Yang Y，Yang C，Zhu Y，et al.Intragenic and extragenic disruptions of FOXL2 mapped by whole genome low-coverage sequencing in two BPES families with chromosome reciprocal translocation[J].Genomics，2014，104（3）：170-176.

[9]Bouman A，van Haelst M，van Spaendonk R.Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome caused by a 54-kb microdeletion in a FOXL2 cis-regulatory element[J].Clin Dysmorphol，2018，27（2）：58-62.

[10]Beysen D，Raes J，Leroy BP，et al.Deletion involving long-range conserved nongenic sequences upstream and downstream of FOXL2 as a novel disease-causing mechanism in blepharophimosis syndrome[J].Am J Hum Genet，2005， 77（2）：205-218.

[11]D′haene B，Nevado J，Pugeat M，et al.FOXL2 copy number changes in the molecular pathogenesis of BPES：unique cohort of 17 deletions[J].Hum Mutat，2010，31（5）：E1332-E1347.

[12]Sun M，Ma F，Zeng X，et al.Triphalangeal thumb-polysyndactyly syndrome and syndactyly type Ⅳ are caused by genomic duplications involving the long range，limb-specific SHH enhancer[J].J Med Genet，2008，45（9）：589-595.

[13]Krepelova A，Simandlova M，Vlckova M，et al.Analysis of FOXL2 detects three novel mutations and an atypical phenotype of blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Clin Exp Ophthalmol，2016，44（9）：757-762.

[14]Beysen D，Moumne L，Veitia R，et al.Missense mutations in the forkhead domain of FOXL2 lead to subcellar mislocalization，protein aggregation and impaired transactivation[J].Hum Mol Genet，2008，17（13）：2030-2038.

[15]Kim JH，Bae J.Differential apoptotic and proliferative activities of wild-type FOXL2 and blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome （BPES）-associated mutant FOXL2 protein[J].J Reprod Dev，2014，60（1）：14-20.

[16]程洪波，王濤，王改改，等.一個(gè)瞼裂狹小綜合征家系FOXL2基因的突變分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2018， 35（4）：515-517.

[17]Pisarska MD，Bae J，Klein C，et al.Forkhead l2 is expressed in the ovary and represses the promoter activity of the steroidogenic acute regulatory gene[J].Endocrinology，2004，145（7）：3424-3433.

（收稿日期：2019-02-18? 本文編輯：祁海文）