小漿果中食源性甲型肝炎病毒和諾如病毒流行狀況及檢測方法的研究進(jìn)展

馮華煒，艾海新,2，楊天舟，齊夢園，譚燕妮，麻麗丹，劉宏生,2,*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省生物大分子模擬計(jì)算與信息處理工程研究中心，遼寧 沈陽 110036；3.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000）

食源性甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）和諾如病毒（norovirus，NoV）（基因型I（GI）和II（GII））可以引起人類非細(xì)菌性胃腸炎或傳染性肝炎，甚至導(dǎo)致死亡，是全世界重要的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。HAV屬微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），NoV屬杯狀病毒科（Caliciviridae）。HAV和NoV均屬單股正鏈RNA病毒，無包膜，主要通過糞-口途徑傳播，也可通過人-人接觸傳播，或通過受污染的水和食物進(jìn)行傳播[3-6]。食源性HAV和NoV具有低劑量感染（10～100 顆粒[7]）和強(qiáng)傳染性等傳播特性，其中，HAV和NoV在糞便中的顆粒數(shù)可達(dá)106～1012個(gè)/g[8-9]，1 個(gè)NoV顆粒引起的感染率可達(dá)50%，超過了已報(bào)導(dǎo)的任何一種食源性病毒[10]。此外，食源性HAV和NoV還具有很高的環(huán)境適應(yīng)性，在低溫下可存活數(shù)月[11-12]，在60 ℃和68 ℃的高溫下可分別存活30 min和20 min[13]，對高壓、低pH值以及某些消毒劑也具有一定抵抗力[14-15]。通常，這兩種病毒可以通過煮沸快速失活，因此，生的或未煮熟食物極易成為傳播食源性HAV和NoV的載體。

草莓、樹莓、藍(lán)莓等小漿果被譽(yù)為“第三代”水果，因含有豐富的保健營養(yǎng)成分，受到廣大消費(fèi)者的青睞[16]。但是，隨著全球小漿果消費(fèi)量的持續(xù)增長[17]，新鮮和冷凍小漿果中與食源性HAV和NoV有關(guān)的感染事件也在逐年上升。據(jù)調(diào)查，1983—2014年間，歐洲范圍內(nèi)與冷凍小漿果有關(guān)的HAV和NoV污染事件分別達(dá)到1 400 起和32 起[18-19]。2012年，德國發(fā)生了全球最大規(guī)模的食源性NoV感染冷凍草莓事件，感染人數(shù)達(dá)10 952 人，涉及到400多所學(xué)校和日托中心，使得小漿果這一食源性病毒傳播載體得到了全世界的高度重視[20]。在對該次爆發(fā)事件的污染來源調(diào)查中，相關(guān)研究的病毒回收率僅在0%～1%之間[21]，暴露出受污染小漿果在食源性病毒檢測中存在缺陷。

為確保小漿果類食品的安全，本文擬從以下3 個(gè)方面進(jìn)行綜述：1）調(diào)查食源性HAV和NoV在小漿果中的流行狀況，為甲型肝炎和腹瀉性疾病的爆發(fā)預(yù)警提供數(shù)據(jù)；2）提出食源性HAV和NoV的提取和核酸檢測方法的最新知識(shí)，為完善食源性HAV和NoV的檢測方法提供思路；3）闡述檢測過程控制在食源性病毒檢測中的應(yīng)用情況，為準(zhǔn)確評(píng)估檢測結(jié)果、合理解釋檢測數(shù)據(jù)提供幫助。

1 與小漿果有關(guān)的HAV和NoV的流行狀況

小漿果靠近地表面生長，無法運(yùn)用機(jī)械采摘，極易受氣候條件、灌溉水、土壤環(huán)境、采摘人員的影響[9]。新鮮小漿果極易腐爛，通常不進(jìn)行清洗或消毒處理[22]，具有潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。此外，某些食源性病毒可與小漿果表面的土著微生物（如Bacillus spp.、Erwinia spp.、Pseudomonas spp.）分泌的胞外聚合物進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)了它們的污染能力[23]。大量的研究表明，小漿果已成為傳播食源性病毒的重要媒介[19]，其中食源性NoV和HAV為污染小漿果的兩種重要病原菌[18,24]。

圖1 1988—2017年RASFF數(shù)據(jù)庫中HAV和NoV的在小漿果中的爆發(fā)和分布情況[29]Fig. 1 Outbreak and distribution of HAV and NoV in berries based on RASFF database from 1988 to 2017[29]

在歐洲，第一例小漿果中HAV和NoV的感染事件分別發(fā)生于1983年[25-26]和1987年[27]。根據(jù)食品與飼料快速預(yù)警系統(tǒng)（rapid alert system for food and feed，RASFF）的數(shù)據(jù)[28-29]（圖1），在1998—2017年間，歐盟小漿果中污染NoV的通告數(shù)達(dá)69 條，污染HAV的通告數(shù)達(dá)9 條，污染呈逐年增長趨勢。作為歐洲小漿果的主要生產(chǎn)國，2013—2014年間意大利因HAV污染小漿果引發(fā)的病例數(shù)達(dá)到1 803 起[5]。由于HAV和NoV在冷凍后仍具有完整基因和結(jié)構(gòu)，因此在所有受污染的小漿果產(chǎn)品中，冷凍類型的漿果成為潛在的高風(fēng)險(xiǎn)食物，如冷凍樹莓的污染占所有農(nóng)產(chǎn)品的23.7%[9-10,28]。1998年，第一例與小漿果有關(guān)的HAV和NoV感染事件分別發(fā)生于美國的艾奧瓦州和得克薩斯州[30]。根據(jù)美國疾病與預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的數(shù)據(jù)[30]（圖2），1988—2016年間，HAV和NoV在小漿果中爆發(fā)達(dá)22 次，導(dǎo)致673 人患病，67 人住院。其中，2013年爆發(fā)的HAV污染小漿果事件規(guī)模最大，涉及美國十幾個(gè)州，感染人員達(dá)150 人，住院人數(shù)比例達(dá)44%[9]。在所有污染的食物中，小漿果混合食物（如含小漿果的沙拉或甜點(diǎn)）占主要位置，其次為小漿果單獨(dú)引起的污染，如HAV和NoV在草莓中引起的感染次數(shù)分別為2 次和3 次[30]。

圖2 1998—2016年美國小漿果產(chǎn)品中的HAV和NoV引起的食源性疾病[30]Fig. 2 Outbreak of foodborne diseases caused by HAV and NoV in American berry products from 1998 to 2016[30]

在中國，食源性HAV和NoV已成為威脅人們健康的巨大隱患。從“大中華食品安全信息庫”（http://kwanlab.bio.cuhk.edu.hk/FS/）[31-32]中搜索的結(jié)果顯示（圖3），2006—2017年間，關(guān)于食源性NoV和HAV的新聞和論文分別為278 條和43 條，其中，2013—2015年廣東省NoV爆發(fā)了52 次[33]，2014—2016年青島市食源性NoV爆發(fā)了23 次[34]。國內(nèi)食源性HAV和NoV的溯源調(diào)查顯示，貝類產(chǎn)品為主要的污染源，小漿果作為污染源的數(shù)據(jù)很少[35-36]。但是，這并不能說明我國的小漿果產(chǎn)品是安全的，房保海等[37]對果蔬產(chǎn)品（216 份）中HAV的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果顯示，小漿果產(chǎn)品的陽性率占到了1.85%。根據(jù)1998—2017年RASFF的通報(bào)數(shù)據(jù)顯示，中國出口小漿果污染NoV達(dá)8 例，引發(fā)的食物中毒爆發(fā)3 次，反映出我國小漿果具有潛在的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)[29]?，F(xiàn)有研究狀況顯示，由于病毒檢測技術(shù)不成熟，無法對具有潛在污染的高風(fēng)險(xiǎn)食品進(jìn)行檢測，從而給中國小漿果產(chǎn)品的污染監(jiān)測和評(píng)估帶來困難[34]。

圖3 中國食源性HAV和NoV的發(fā)生情況[32]Fig. 3 Occurrence of foodborne HAV and NoV infections in China[32]

2 小漿果中食源性病毒的檢測方法

2.1 病毒提取方法

2.1.1 病毒洗脫-濃縮法

在食源性病毒的提取方法中，基于病毒洗脫-濃縮的方法在小漿果中得到廣泛應(yīng)用，其中堿性洗脫結(jié)合聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀的方法應(yīng)用最廣。病毒洗脫-濃縮法主要包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟：1）從食品基質(zhì)中洗脫釋放病毒；2）從洗脫液中濃縮病毒。

完整的病毒洗脫是保證病毒顆粒完整提取的重要基礎(chǔ)。在小漿果樣品的病毒洗脫過程中，大量果膠的存在會(huì)抑制小漿果樣品中病毒的提取效率，在草莓中加入果膠酶可將HAV的檢測靈敏度提高3 倍[38]，在含藍(lán)莓的沙拉中加入果膠酶可將NoV GI和NoV GII的回收率提高2～6 倍[39]。不同洗脫液在食源性病毒檢測中應(yīng)用效果已有評(píng)估[38,40]（表1），常用洗脫液為國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）/歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)中的Tris-甘氨酸-牛肉浸提物洗脫液（Tris-glycine-beef extract，TGBE）[21,38-39,41]，在該洗脫液中，Tris可以保持洗脫液的緩沖能力，甘氨酸用來減少病毒顆粒對食物成分的非特異性吸附。王飛等[42]的研究表明Tralk洗脫液在草莓中的洗脫效果優(yōu)于TGBE洗脫液和NaOH洗脫液。也有研究指出，食品表面產(chǎn)生的氣泡有助于病毒粒子在食品表面進(jìn)行充分釋放，進(jìn)而提高病毒的洗脫效率[43-44]。Summa等[45]認(rèn)為以碳酸鹽為基礎(chǔ)的緩沖液可以在樹莓表面形成氣泡，對NoV具有更高的洗脫效率。研究表明，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）可有效去除小漿果中的多酚物質(zhì)。Hida等[46]在TGBE洗脫液中加入PVP，使得葡萄中鼠諾如病毒-1（murine norovirus 1，MNV-1）的回收率提高了5 倍。

洗脫后的病毒顆粒存在于大體積的洗脫液中，對病毒濾液進(jìn)行濃縮以獲得高濃度、高純度的完整病毒顆粒對于之后的核酸提取極其重要。盡管有研究表明超濾法[39]和超速離心法[46]在病毒的濃縮中具有良好的病毒回收率，但從總體來看，具有高親水性的高分子聚合物PEG，可以通過吸收洗脫液中的水分來減少病毒之間的距離，對食源性病毒具有更好的濃縮效果[21,41,47-48]。但在食源性病毒提取過程中，PEG沉淀法會(huì)產(chǎn)生許多與病毒無關(guān)的小分子物質(zhì)沉淀，對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)[49-50]。Bartsch等[41]在PEG沉淀病毒后采用MobiSpin S-400 columns對冷凍草莓中NoV提取物進(jìn)行抑制劑去除，NoV GI的檢出率從22.3%提升至59.1%，NoV GII的檢出率從40.1%提高至90.9%，有效提高了TGBE-PEG沉淀法的提取效率。

2.1.2 直接提取病毒法

表1 不同病毒提取方法的比較Table 1 Comparison of different virus extraction methods

病毒洗脫-濃縮法通常較為復(fù)雜，尤其是針對容易釋放大量酸性物質(zhì)的小漿果時(shí)，需對洗脫液的pH值進(jìn)行反復(fù)調(diào)節(jié)，同時(shí)進(jìn)行多次孵育來釋放病毒，完成病毒提取所需的理論時(shí)間大約為150 min。目前，直接向小漿果樣品表面添加裂解液的病毒提取方法得到了一定應(yīng)用（表1），具體步驟為：1）樣品中添加裂解液，室溫孵育5 min；2）室溫條件下15 000×g離心5 min，提取病毒RNA。該法操作步驟簡單，將病毒提取時(shí)間縮短了15 倍，具有很好的病毒提取效率。Perrin等[51]采用該法對樹莓樣品進(jìn)行檢測，病毒回收率為46.2%，顯著高于病毒洗脫-濃縮法（20.3%）。Summa等[45]對直接提取病毒法進(jìn)行了改良，即收集1 mL的解凍樹莓汁液后加入250 μL PEG/NaCl溶液（含50 g、100 mL PEG 8000、1.5 mol/L NaCl）進(jìn)行沉淀，該法對9 份自然污染的冷凍樹莓（100 拷貝數(shù)）進(jìn)行檢測時(shí)，NoV GII.4的陽性檢出率可達(dá)44.4%，提取效率（32%）高于病毒洗脫-濃縮法（24%）。受抑制物的影響，直接提取病毒法仍無法應(yīng)用于其他類型小漿果的檢測，該法在草莓中的病毒提取率僅為0.52%[41]。

2.2 病毒檢測方法

2.2.1 RT-PCR方法

采用非特異性的置入染料或者特異性探針在“實(shí)時(shí)”方式下檢測病毒RNA的實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）法是食源性HAV和NoV檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，廣泛應(yīng)用于草莓、樹莓、藍(lán)莓等小漿果樣品的檢測[16,39,54]。在食源性HAV的檢測過程中，高度保守的5’NCRs是設(shè)計(jì)HAV引物探針的理想?yún)^(qū)域[55-61]（圖4）。目前，很多食源性HAV操作規(guī)程都依據(jù)該區(qū)域設(shè)計(jì)RTPCR引物和探針[62-64]，最佳的RT-PCR引物探針對已被納入ISO標(biāo)準(zhǔn)。開放式閱讀框(ORF)1-ORF2連接區(qū)域是NoV最保守的區(qū)域，對NoV所有的基因型具有高水平的核酸序列一致性[49,65-66]（圖5），這個(gè)特征使得(ORF)1-ORF2成為設(shè)計(jì)NoV實(shí)時(shí)RT-PCR引物的理想?yún)^(qū)域[16,62-63]。在食源性NoV的檢測過程中，不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的方法、不同的樣本，都會(huì)影響實(shí)時(shí)RT-PCR的檢測結(jié)果。此外，NoV的高度變異性及持續(xù)進(jìn)化性也會(huì)影響NoV的檢測靈敏性[67]；因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測和修訂實(shí)時(shí)RT-PCR中的引物探針就變得極其重要。Yoo等[68]對常用的4 種NoV GII和NoV GII引物探針對進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明在探針中加入ZEN猝滅劑后可有效增加病毒的檢測靈敏度，同時(shí)降低PCR檢測過程中的背景信號(hào)。

圖4 HAV基因組的示意圖以及在HAV檢測和基因分型中常用的引物和探針的位置[55-61]Fig. 4 Schematic diagram of HAV genome and location of primers and probes commonly used in HAV detection and genotyping[55-61]

在單重定量RT-PCR（RT-quantitative PCR，RT-qPCR）法中，一個(gè)樣本在檢測不同的病毒時(shí)，檢測所需的核酸量取決于待檢病毒的種類，檢測效率較低，不適用于檢測食源性疾病爆發(fā)中的稀有樣品。在同一反應(yīng)管中進(jìn)行多重病毒檢測的多重實(shí)時(shí)RT-PCR檢測技術(shù)（multiplex RT-PCR，MRT-PCR）的應(yīng)用進(jìn)一步提高了病毒的檢測效率，與單重RT-qPCR相比，MRT-PCR可縮短50%的檢測時(shí)間，顯著降低試劑耗材費(fèi)用。但是受PCR熒光檢測通道的影響，病毒在MRT-PCR擴(kuò)增過程中會(huì)產(chǎn)生相互抑制作用，在NED、FAM和VIC熒光通道中，草莓樣品中HAV、NoV GI和NoV GII的檢測靈敏度分別為31.4 CCID50/20 g、56.2 RT-PCR50/20 g和31.6 RT-PCR50/20 g[69]。為了解決這種缺陷，微流體定量PCR（microfluidic quantitative PCR，MFQPCR）技術(shù)進(jìn)一步得以發(fā)展。在MFQPCR技術(shù)中，一個(gè)芯片上可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)納升級(jí)（10-12L）的qPCR，例如，一個(gè)96.96 Dynamic Array芯片上可同時(shí)進(jìn)行9 216 個(gè)qPCR，可對96 個(gè)樣品中的96 種病毒同時(shí)進(jìn)行檢測[70]。Ishii等[71]采用MFQPCR技術(shù)對11 種腸道病毒進(jìn)行了檢測，并從污水中檢測出NoV GI、NoV GII和輪狀病毒。Oshiki等[72]采用MFQPCR技術(shù)對臨床和食品中的11 種腸道病毒進(jìn)行分型，該法在牡蠣中的檢測靈敏度為102～105拷貝數(shù)/g。目前，MFQPCR技術(shù)在食源性腸道病毒的高通量檢測與分型中得以應(yīng)用，在小漿果的食源性病毒調(diào)查中應(yīng)用較少。

2.2.2 數(shù)字PCR方法

基于相對基因組定量的RT-qPCR方法需要采用標(biāo)準(zhǔn)品（DNA或RNA）進(jìn)行校準(zhǔn)，定量結(jié)果容易產(chǎn)生偏差，對弱陽性樣本（Ct值≥40）難以進(jìn)行定量，且存在嚴(yán)重的RT-PCR抑制效應(yīng)[73-75]。采用微量核酸直接測定基因拷貝數(shù)的數(shù)字RT-PCR（digital RT-PCR，dRT-PCR）技術(shù)可以解決這一缺陷[76]。dRT-PCR方法通過將樣本（微升體積）稀釋分配到微流體芯片或微液滴中，采用與RT-qPCR相同的引物和探針進(jìn)行大量單獨(dú)的熒光PCR擴(kuò)增，使得每個(gè)反應(yīng)中包含1 個(gè)或0 個(gè)目標(biāo)核酸拷貝數(shù)，最后通過泊松分布計(jì)算原始樣本中核酸的拷貝數(shù)[77]。目前，dRT-PCR技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)菌性食源微生物的定量檢測，少量應(yīng)用于食源性腸道病毒的定量檢測[78-79]。由于dRT-PCR是在RT-PCR終點(diǎn)進(jìn)行陽性擴(kuò)增的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，對小漿果中的RT-PCR抑制物具有更高的耐受性。Fraisse等[80]對冷凍草莓、冷凍樹莓和冷凍混合莓進(jìn)行dRT-PCR和RT-qPCR檢測，結(jié)果顯示dRT-PCR（0%～96%）的抑制效率顯著低于RT-qPCR（4%～77%），過程控制在dRT-PCR反應(yīng)體系中無需進(jìn)行10 倍體積稀釋。此外，dRT-PCR具有較高的檢測靈敏度，在草莓樣品中NoV的檢測限為185 拷貝數(shù)/25 g，高于RT-qPCR法的257 拷貝數(shù)/25 g[81]。在檢測低水平拷貝數(shù)樣品時(shí)精確度和重復(fù)性更優(yōu)，適用于混合感染小漿果食物及其加工制品中的食源性病毒檢測，但是dRT-PCR法的最低檢測限在低污染小漿果中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[80]。2.2.3 下一代測序技術(shù)

圖5 NoV基因組的示意圖以及在NoV檢測和基因分型中常用的引物和探針的位置[49,65-66]Fig. 5 Schematic diagram of NoV genome and location of primers and probes commonly used in NoV detection and genotyping[49,65-66]

基于PCR的方法擴(kuò)增片段較?。ㄐ∮?00 bp），且高度依賴引物探針，因此不能區(qū)分食源性病毒的感染性與非感染性，對病毒的基因分析也受到一定限制[82]。利用下一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）對病毒的宏基因組進(jìn)行分析，不僅有利于對食源性致病菌達(dá)到分子水平上的整體深入認(rèn)識(shí)，同時(shí)也給食源性病毒的快速檢測提供了更靈敏、更特異的技術(shù)可能。NGS的原理類似于Sanger測序，即在DNA模板重新合成一個(gè)片段的過程中，對每一個(gè)小片段DNA的堿基序列的實(shí)時(shí)識(shí)別。NGS以一種大規(guī)模并行的方式將這個(gè)過程擴(kuò)展到數(shù)百萬個(gè)反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)了病毒全基因組的高通量快速測序。在合適的測序深度下（食源性病毒基因組較小，測序結(jié)果中注釋到病毒的序列較少，所需測序深度可達(dá)上百倍），NGS可以完成食品樣品中常見和罕見的NoV變異序列的分析[83]。Imamura等[84]采用NGS技術(shù)對日本牡蠣中NoV的多樣性進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)5 種NoV基因型（GII.3、GII.4、GII.13、GII.16和GII.17），同時(shí)區(qū)分了NoV的感染性與非感染性。NGS技術(shù)還具有很高的靈敏度，可以從人工污染的芹菜檢測出低于103拷貝數(shù)的HAV和NoV[85]。作為一種無目標(biāo)的方法，NGS技術(shù)可用于食源性疾病爆發(fā)事件的污染源調(diào)查。Bartsch等[81]采用該技術(shù)對2012年德國爆發(fā)NoV感染事件中的冷凍草莓進(jìn)行檢測，成功檢測出2 株NoV（NoV GII.P16和NoV GII.13）。目前的研究表明，測序過程中產(chǎn)生大量與植物相關(guān)的序列（87.06%）使得與病毒相關(guān)的序列（0.01%）相對較少，是目前限制NGS用于小漿果中食源性病毒檢測的障礙。未來仍需通過各種方法對NGS技術(shù)進(jìn)行完善，例如通過樣品的DNases處理去除測序過程中產(chǎn)生干擾序列。

3 檢測過程控制

基于PCR的方法在食源性病毒的檢測中分為3 個(gè)步驟：1）病毒提?。?）病毒RNA提?。?）RT-PCR檢測。在病毒檢測過程中，抑制效應(yīng)發(fā)生于各個(gè)檢測階段。首先，食品樣品基質(zhì)中存在大量的RT-PCR抑制物會(huì)影響食源性病毒的有效提取，如小漿果中存在的果膠、鞣質(zhì)酸會(huì)影響病毒的濃縮；其次，病毒RNA提取過程中提取試劑、食品基質(zhì)成分的殘留同樣會(huì)對RT-PCR產(chǎn)生抑制作用，如來自小漿果中的酚類、多糖物質(zhì)，可隨病毒RNA的提取共同被提取出，對RT-PCR擴(kuò)增造成干擾[86]；最后，RT-PCR檢測中，RNA提取試劑的殘留、引物探針和酶的質(zhì)量也會(huì)影響病毒的擴(kuò)增效率。針對各檢測階段中抑制物的去除方法已有大量研究[87-88]，如RT-PCR擴(kuò)增前使用One-StepTMPCR Inhibitor Removal Kit去除抑制劑。但是沒有一種方法能夠徹底去除病毒檢測中存在的抑制物質(zhì)，因此需在病毒檢測過程中建立完善的質(zhì)量控制（過程控制），來判定病毒檢測結(jié)果的可靠性。依據(jù)添加位置的不同，過程控制被分為3 個(gè)類型（圖6）：1）全程過程控制（whole process controls，WPCs）：在病毒提取前加入；2）分子過程控制（molecular process controls，MPCs）：在核酸提取前加入；3）RT-PCR控制：在RT-PCR擴(kuò)增前加入。另外，過程控制的提取效率需滿足一定的水平，通常將病毒RNA的提取效率分為3 個(gè)水平：低（小于1%）、可接受（1%～10%）和良好（超過10%）[89]。當(dāng)RNA提取效率小于1%時(shí)，需重新進(jìn)行病毒富集或病毒RNA的提取。

圖6 過程控制在食源性病毒檢測過程中的應(yīng)用框架圖Fig. 6 Framework of process controls used for virus detection in foods

3.1 全程過程控制

在確定目標(biāo)病毒的提取效率時(shí)，在樣本中加入一定量的過程控制可以反映目標(biāo)病毒的回收效率。這種過程控制的回收率既受濃縮效率的影響，也受RNA提取效率和RT-PCR的影響。因此接種于樣品中的過程控制是一個(gè)典型的WPCs?？膳囵B(yǎng)的病毒顆粒是評(píng)估食源性病毒提取效率的理想WPCs（表2），這些病毒與待檢目標(biāo)病毒具有相似的形態(tài)、遺傳、環(huán)境持久性，更不會(huì)出現(xiàn)在待檢的污染樣品中[48,90]。WPCs在食源性HAV和NoV檢測中的應(yīng)用研究顯示，WPCs和目標(biāo)病毒的相關(guān)性主要取決于食品基質(zhì)的類型。如MNV可以有效指示NoV GI和NoV GII在小漿果中的回收率[91]，但不能指示瓶裝水或半干番茄中NoV GI的回收率[92]。同一WPCs在不同類型的食品中也具有不同的回收率，如MNV在草莓中的回收率為（20.69±2.89）%，在樹莓中的回收率卻為（17.36±1.57）%[39,93]。此外，病毒提取過程中發(fā)生的大量損失也是影響WPCs回收率的主要原因之一。不同WPCs的損失位置也有很大差異，MNV-1和MS2噬菌體的損失主發(fā)生在病毒濃縮過程中，杜蘭病毒（Tulane virus，TV）的損失發(fā)生在病毒洗脫和濃縮過程中[94]。在指示目標(biāo)病毒的提取效率時(shí)，WPCs的加入量應(yīng)大于或等于WPCs在待檢樣品中的檢測限。例如，當(dāng)MNV-1在瓶裝水、西紅柿和生菜中的檢測限分別為106、107、108拷貝數(shù)時(shí)，該WPCs在樣品中添加量應(yīng)大于108拷貝數(shù)[92]。

3.2 分子過程控制

WPCs的指示效率容易受下游操作的影響（如病毒RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增中存在的抑制效應(yīng)），從而導(dǎo)致同一WPCs在相同的樣品中表現(xiàn)出不同的提取效率，因此針對不同檢測階段采取不同的過程控制極為重要。在提取好的病毒沉淀或溶液中加入一定量的MPCs進(jìn)行共同提取（原倍MPCs與10 倍體積稀釋的Ct值之差在3.3左右[95]），可以有效指示病毒RNA提取過程中發(fā)生的抑制效應(yīng)。WPCs的添加量需進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，含量過高會(huì)抑制目標(biāo)病毒，含量過低會(huì)降低檢測限。研究表明，MS2的含量為104拷貝數(shù)/mL時(shí)，對目標(biāo)病毒的影響可以忽略不計(jì)[96]。

基于基因相似的病毒具有相似的核酸提取效率的理論，門哥病毒（Mengo virus，MgV）常用來指示食源性HAV的RNA提取效率[62-64,92,97]。在ISO標(biāo)準(zhǔn)中，MgV也被用作指示食源性NoV RNA提取效率的MPCs[62-63]。此外，MNV和TV也是小漿果樣品中檢測NoV常用的MPCs[98]。但是，MNV和NoV在臨床表現(xiàn)、宿主受體發(fā)病機(jī)制和感染的細(xì)胞類型等方面還有一些差別[99]。由于MNV的功能受體為唾液酸[100]，而NoV的功能受體為組織血型抗原（histo-blood group antigens，HBGA）[101]，因此能夠識(shí)別A型和B型HBGA作為受體進(jìn)行感染的TV似乎更適合作為NoV的MPCs[102]。作為過程控制的天然病毒具有致病性，對實(shí)驗(yàn)室條件有很高的要求，因此采用包被特定病毒基因的裝甲R(shí)NA技術(shù)得到發(fā)展，其中采用該技術(shù)構(gòu)建的MS2噬菌體樣病毒顆粒得到廣泛應(yīng)用，可以對食源性HAV和NoV的RNA提取和濃縮效率進(jìn)行有效控制[96]。

與相似理論不同的是，基因相似的MPCs似乎不能一直具有相同的核酸提取效率，核酸的提取效率多取決于待檢病毒類型及待檢食品類型。Hennechart-Collette等[92]的研究表明，MNV-1適用于檢測瓶裝水、西紅柿和生菜中的HAV，不適于檢測瓶裝水和生菜中的NoV GI和NoV GII，而MgV更適用于檢測瓶裝水和生菜中的NoV GI和NoV GII。因此，在實(shí)際檢測工作中，需針對不同類型的食品基質(zhì)，采用不同的MPCs進(jìn)行核酸提取效率的監(jiān)控。

3.3 RT-PCR過程控制

在RT-PCR階段，核酸反轉(zhuǎn)錄的平均效率僅為20%[103]，同一個(gè)RT-qPCR反應(yīng)也會(huì)出現(xiàn)不同的擴(kuò)增效率，因此在含有WPCs的核酸溶液中加入特定的DNA或RNA，是評(píng)估目標(biāo)病毒RT-PCR抑制效應(yīng)的有效方法。當(dāng)RT-PCR過程控制的抑制指數(shù)小于2.0時(shí)，表明WPCs具有良好的提取效率，也表明RT-PCR擴(kuò)增效果良好[90]。在食源性病毒的檢測中，各種類型的DNA或RNA可以作為RT-PCR過程控制（表2）。其中，靶病毒的DNA質(zhì)?；騌NA序列經(jīng)常被用作RT-PCR控制[104-106]，這種控制可以和目標(biāo)病毒采用相同的引物和探針進(jìn)行檢測。但是，當(dāng)反應(yīng)體系中存在抑制物質(zhì)時(shí)，過程控制和目標(biāo)病毒在同一反應(yīng)管的擴(kuò)增效率就很難準(zhǔn)確計(jì)算。此外，使用該類RT-PCR控制容易引起待檢核酸樣品的污染，導(dǎo)致“假陽性”檢測結(jié)果的產(chǎn)生。此外，在PCR反應(yīng)體系中加入外部擴(kuò)增控制也可以指示RT-PCR的抑制效應(yīng)。該類過程控制與目的基因序列共用同一對擴(kuò)增引物，通過擴(kuò)增產(chǎn)物大小或熒光標(biāo)記與靶病毒進(jìn)行區(qū)分，避免了在PCR反應(yīng)體系中多對引物間的相互作用，可用小漿果樣品中病毒RT-PCR抑制效應(yīng)的監(jiān)測[64,80]。

表2 食源性HAV和NoV檢測過程中常用的過程控制類型Table 2 Types of process controls used in the detection of foodborne HAV and NoV

4 結(jié) 語

食源性HAV和NoV引發(fā)的小漿果產(chǎn)品感染已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一，而且已經(jīng)有愈演愈烈的趨勢。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，受污染小漿果主要集中于歐盟地區(qū)，感染類型為草莓和樹莓，由于檢測技術(shù)的限制在中國少有報(bào)道統(tǒng)計(jì)。然而，已有的資料僅僅是冰山一角，由于缺乏合適的檢測方法對低劑量病毒感染的食物進(jìn)行的檢測，使得50%的病毒引起的食源性感染不為人們所知[111]，這意味著小漿果產(chǎn)品中食源性病毒的快速檢測仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。針對爆發(fā)的食源性HAV和NoV污染物的檢測結(jié)果顯示，HAV和NoV在小漿果中分布不均勻，同一批次樣品存在比例不同的陰性和陽性樣本，進(jìn)一步加大了食源性病毒檢測檢測難度[49]，而國際權(quán)威的ISO標(biāo)準(zhǔn)只對檢測所需的取樣量進(jìn)行規(guī)定，缺乏小漿果批次產(chǎn)品的采樣標(biāo)準(zhǔn)[62-63]。因此，建立可靠的采樣標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法是解決污染小漿果產(chǎn)品農(nóng)產(chǎn)品中低劑量HAV和NoV不均勻分布的問題的有效途徑。

在食源性HAV和NoV的檢測中，病毒提取、核酸檢測和檢測過程控制是三大關(guān)鍵因素。在病毒提取中，洗脫-濃縮法成為常規(guī)提取方法，在洗脫緩沖液中加入PVP、果膠酶等物質(zhì)可以減少食品基質(zhì)效應(yīng)的影響，利用食品表面產(chǎn)生的氣泡充分釋放吸附于食品表面的病毒顆粒，采用直接提取病毒RNA法在特定漿果中也有一定應(yīng)用，但是如何盡可能地去除提取過程中產(chǎn)生的抑制物質(zhì)、完善病毒提取方法的適用性仍然面臨挑戰(zhàn)。在核酸檢測方面，基于PCR的方法是食源性病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其中，單重RT-qPCR和MRT-qPCR方法檢測效率低，不適用于大樣本的檢測；MFQPCR可以實(shí)現(xiàn)小漿果產(chǎn)品中食源性病毒的高通量檢測與分型，但是盡可能地去除PCR抑制物質(zhì)仍然是研究人員需要努力的方向；絕對定量的數(shù)字PCR技術(shù)對抑制物的耐受性強(qiáng)于RT-qPCR方法，具有很高的靈敏度，適用于高抑制劑食物的無標(biāo)定量檢測，但是該法的最低檢測限在弱陽性小漿果樣本中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步驗(yàn)證；采用NGS技術(shù)對病毒宏基因組進(jìn)行分析，不但可以實(shí)現(xiàn)未知病毒的定量檢測與分型，還可以判斷病毒的感染性，已在NoV的病毒學(xué)監(jiān)測[112]和環(huán)境監(jiān)測[113]中得到一定應(yīng)用，是最有前景的食源性病毒分析方法之一，但是有效去除干擾序列是下一步所期待解決的問題。在檢測過程中評(píng)估病毒回收率的過程控制可分為3 種類型：WPCs、MPCs和RT-PCR控制，也有各種類型的過程控制應(yīng)用于各個(gè)檢測階段，但迄今為止還未建立既可用于控制又能保持適當(dāng)回收率的過程控制“金標(biāo)準(zhǔn)”；其次，在評(píng)估檢測過程的整體性能時(shí)，不僅需要考慮單個(gè)樣本的回收率，更要考慮樣本的平均回收率，才可以實(shí)現(xiàn)檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確解釋；最后，利用裝甲R(shí)NA技術(shù)構(gòu)建非致病性的病毒樣顆?？梢詫Σ《镜臋z測效率進(jìn)行指示，但在實(shí)際檢測過程中，仍需考慮病毒樣顆粒對目標(biāo)病毒的適用性。

源頭控制是食源性疾病防控的一個(gè)重要手段，通過建立可靠的采樣標(biāo)準(zhǔn)和良好的檢測方法，可以快速溯源爆發(fā)中可疑的污染源。此外，建立小漿果食源性HAV和NoV爆發(fā)數(shù)據(jù)庫，利用大數(shù)據(jù)分析方法建立食源性HAV和NoV爆發(fā)預(yù)測模型，從時(shí)間、空間、生產(chǎn)鏈等方面對小漿果產(chǎn)品中可能發(fā)生的食源性病毒感染進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測，進(jìn)而從源頭上防控食源性HAV和NoV病毒的爆發(fā)和感染。