酸應(yīng)激對(duì)大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響

王嫻靜，董 晨，禹金龍，胡 潔，付文靜，張 蘇，江 蕓,*

（1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009）

近年來(lái)，食源性致病菌生物菌膜已成為食品安全領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[1-2]。生物菌膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而黏附、生長(zhǎng)于組織表面，在菌體-菌體和菌體-接觸面的相互作用下，通過(guò)菌體增殖、分泌胞外基質(zhì)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的細(xì)菌聚集體[3-4]。形成菌膜后，細(xì)菌菌體對(duì)外界環(huán)境的抵抗力會(huì)大大增強(qiáng)，對(duì)工業(yè)清洗劑和消毒劑具有更強(qiáng)耐受性，不易清除，殘留的生物菌膜可在環(huán)境適宜時(shí)脫落出細(xì)菌菌體，成為潛在污染源，進(jìn)一步造成交叉污染，引發(fā)嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題[5-6]。大腸桿菌O157:H7是全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的食源性致病菌，每年都會(huì)爆發(fā)多起因大腸桿菌O157:H7污染而引發(fā)的食物中毒事件。有研究表明，大腸桿菌O157:H7在固體表面（如加工器械表面、畜禽胴體表面等）產(chǎn)生黏附的特性是其造成交叉污染的主要原因[7]。

大腸桿菌O157:H7等食源性致病菌大多是嗜中性菌。然而食品加工過(guò)程常存在低pH值環(huán)境，如使用酸性洗液和酸性食品添加劑、酸乳和發(fā)酵香腸等酸性食品的加工與貯藏等。目前關(guān)于食品加工環(huán)境影響食源性致病菌生物菌膜生長(zhǎng)的研究較多集中在各類(lèi)環(huán)境因子（如培養(yǎng)基類(lèi)型、溫度、pH值、接觸面類(lèi)型）的影響作用[8-11]，而結(jié)合食品實(shí)際加工環(huán)境探究較長(zhǎng)時(shí)間酸應(yīng)激對(duì)食源性致病菌生物菌膜形成的影響，可以揭示菌膜形成的真實(shí)規(guī)律，有助于針對(duì)性地制定消除和控制菌膜的策略和有效措施，具有更為現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

因此，本研究以大腸桿菌O157:H7為對(duì)象，通過(guò)比較不同菌株黏附性能，選擇代表菌株分析在較長(zhǎng)時(shí)間酸應(yīng)激時(shí)其生物菌膜形成規(guī)律，進(jìn)一步采用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）比較黏附力不同的菌株在酸性環(huán)境下生物菌膜形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。本研究將為酸性食品實(shí)際生產(chǎn)加工中大腸桿菌O157:H7風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論參考，為研究致病菌生物菌膜的有效防控技術(shù)提供科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌O157:H7共14 株，包括菌株CICC21530（購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心）菌株ATCC43895（購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心）、菌株NCTC12900（購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），其余11 株為南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離自牛肉和牛糞[12]。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂酵母提取物（tryptone soya agar yeast extract，TSAYE）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；LIVE/DEAD?BacLight Bacterial Viability Kits（L7012）美國(guó)Molecular Probes公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、結(jié)晶紫、乳酸、戊二醛、鋨酸、乙醇 南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；SZX超凈工作臺(tái) 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國(guó)Baker公司；拍打式均質(zhì)器 青島眾瑞智能儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；QL-200微型漩渦混合儀 海門(mén)其林貝爾儀器有限公司；2-16KL高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710 CLSM德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

凍藏的14 株大腸桿菌O157:H7經(jīng)TSA平板劃線(xiàn)，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至3 mL TSB中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，再吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接至100 mL TSB中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，使菌液濃度達(dá)到108CFU/mL左右。取1 mL培養(yǎng)好的菌液離心（6 000×g、5 min、4 ℃），棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌2 次，重懸后備用。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7黏附性能比較

采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法[13-14]。取500 μL備用菌液，接種至一定體積TSB中（菌體濃度約為2～3（lg（CFU/mL））。吸取180 μL置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，封口膜包被，于25 ℃培養(yǎng)72 h，以不接種細(xì)菌的TSB作為空白對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去微孔中的細(xì)菌培養(yǎng)液，無(wú)菌蒸餾水洗滌3 次，室溫下干燥45 min后，每孔加入200 μL 0.25 g/100 mL結(jié)晶紫染液染色30 min，棄去染液并用無(wú)菌蒸餾水洗滌3 次，200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液洗脫30 min，最后將微孔板置于酶標(biāo)儀中在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值。每個(gè)菌株重復(fù)6 次。

1.3.3 微孔法分析大腸桿菌O157:H7生物菌膜的形成曲線(xiàn)

根據(jù)1.3.2節(jié)結(jié)果，選取生物菌膜形成能力不同的幾株大腸桿菌O157:H7，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行微孔板操作，分別在培養(yǎng)2、4、8、12、16、24、36、48、60、72、120、168 h取樣[15]，以不接種的TSB作為對(duì)照組。經(jīng)結(jié)晶紫染液染色、乙醇洗脫，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，所得OD值按照培養(yǎng)時(shí)間繪制菌膜形成曲線(xiàn)。每個(gè)菌株每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均重復(fù)6 次。

1.3.4 酸應(yīng)激對(duì)菌株生物菌膜形成的影響

根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果選取代表菌株，研究酸應(yīng)激對(duì)其生物菌膜形成的影響。用3 mol/L乳酸溶液和1 mol/L鹽酸溶液分別配制系列pH值梯度（pH 3.5、4.0、4.5、5.0）TSB作為酸性培養(yǎng)液，同時(shí)以未經(jīng)酸處理的正常TSB作為對(duì)照。采用機(jī)械脫落平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌膜形成[16]。

按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行菌液制備，取100 μL備用菌液接種于10 mL載有不銹鋼片的上述不同酸度TSB中，菌液濃度約為106CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜置培養(yǎng)2、4、8、12、24、48、72、120、168 h，規(guī)定時(shí)間取樣后，對(duì)培養(yǎng)裝置里的浮游菌數(shù)和不銹鋼表面形成的生物菌膜進(jìn)行計(jì)數(shù)。生物菌膜計(jì)數(shù)前用無(wú)菌生理鹽水清洗不銹鋼片3 次以去除鋼片表面未黏附的游離菌體，用拍擊-沖擊法采集鋼片表面的黏附菌體，將清洗后的載有生物菌膜的不銹鋼片放入裝有80 mL無(wú)菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，并放入少量無(wú)菌棉，在480 擊/min條件下拍擊60 s，吸取均質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坎贾罷SAYE平板中，37 ℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 酸應(yīng)激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM觀察

根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果選取黏附力不同的代表菌株，采用CLSM比較不同pH值時(shí)代表菌株生物菌膜的結(jié)構(gòu)變化。按1.3.1節(jié)方法制備菌液，取100 μL備用菌液接種于10 mL載有不銹鋼片的酸性和正常TSB中，菌液濃度約為106CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜置培養(yǎng)，分別在24、72 h和168 h取出，無(wú)菌蒸餾水充分洗滌不銹鋼片以去除其上的游離菌體，吸取LIVE/DEAD?熒光染液對(duì)不銹鋼片表面進(jìn)行染色，室溫避光條件下充分作用15 min后，用無(wú)菌蒸餾水充分洗滌不銹鋼片以除去多余熒光染料，室溫避光條件下放置自然干燥，使用CLSM（60×，油鏡）觀察染色后的生物菌膜結(jié)構(gòu)。LIVE/DEAD?為由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）復(fù)配的熒光染料；其中SYTO 9激發(fā)波長(zhǎng)和吸收波長(zhǎng)分別為480 nm和500 nm，可以將生物菌膜中具有完整細(xì)胞膜的菌體（活菌）染成綠色，PI激發(fā)波長(zhǎng)和吸收波長(zhǎng)分別為490 nm和635 nm，可以將生物菌膜中細(xì)胞膜損傷的菌體（死菌）染成紅色，從而可以區(qū)別生物菌膜中的活菌和死菌[17]。每組隨機(jī)選用10 張CLSM圖像，使用NIS-Element Viewer軟件和Image J 軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌O157:H7不同菌株黏附性能比較

采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法，14 株大腸桿菌O157:H7在聚苯乙烯微孔表面底部可形成淡紫色薄膜，其黏附性能如圖1所示。14 株大腸桿菌O157:H7均具有一定的黏附能力，但存在明顯的菌株差異性，其中菌株J29黏附力最強(qiáng)，顯著高于其他菌株（P＜0.05），菌株ATCC43895黏附力中等，其余12 株黏附力均較弱。

圖1 大腸桿菌O157:H7在微孔板表面生物菌膜形成能力比較（n＝ 6）Fig. 1 Comparison of biofilm formation abilities of E. coli O157:H7 strains on polystyrene microplate surface (n = 6)

2.2 大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成曲線(xiàn)

圖2 大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成曲線(xiàn)（n＝6）Fig. 2 Biofilm formation curves of E. coli O157:H7 (n = 6)

根據(jù)2.1節(jié)結(jié)果，進(jìn)一步選取較強(qiáng)黏附力菌株J29、中等黏附力菌株ATCC43895和4 株較弱黏附力菌株（113、157、236和CICC21530），利用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法繪制各菌株生物菌膜的形成曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2所示。各菌株均在培養(yǎng)2 h時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生黏附，但黏附性能不同的菌株其形成曲線(xiàn)差異明顯，4 株較弱黏附力菌株在2 h后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌膜形成量變化不大，基本維持在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；而中等黏附力菌株ATCC43895和較強(qiáng)黏附力菌株J29菌膜形成量明顯依賴(lài)于培養(yǎng)時(shí)間，其中菌株ATCC43895在培養(yǎng)2 h時(shí)完成初黏附后，2～48 h時(shí)菌膜形成量比較穩(wěn)定，48～168 h時(shí)菌膜形成量呈較快增長(zhǎng)趨勢(shì)；菌株J29在培養(yǎng)2 h時(shí)完成初黏附后，2～24 h時(shí)菌膜形成量比較穩(wěn)定，24～48 h時(shí)菌膜形成量迅速增加，48～168 h時(shí)菌膜形成量呈較緩增長(zhǎng)趨勢(shì)。

2.3 酸應(yīng)激下中等黏附力菌株ATCC43895生物菌膜的形成過(guò)程

根據(jù)2.1節(jié)和2.2節(jié)結(jié)果，進(jìn)一步選取中等黏附力菌株ATCC43895為代表菌株，利用機(jī)械脫落平板計(jì)數(shù)法觀察酸應(yīng)激下不銹鋼表面該菌株生物菌膜的形成。結(jié)果表明，pH 3.5乳酸-TSB的抑菌效應(yīng)強(qiáng)，該菌株浮游菌數(shù)和生物菌膜形成數(shù)量均未達(dá)到檢測(cè)限，而pH 3.5鹽酸-TSB對(duì)該菌株浮游菌數(shù)和生物菌膜數(shù)量影響均較小，故對(duì)pH 3.5乳酸-TSB和pH 4.0、4.5、5.0鹽酸-TSB未作進(jìn)一步研究。pH 4.0、4.5、5.0乳酸-TSB、pH 3.5鹽酸-TSB對(duì)菌株ATCC43895浮游菌數(shù)及其生物菌膜形成過(guò)程的影響如圖3、4所示。

圖3 酸應(yīng)激下菌株ATCC43895浮游菌數(shù)變化（n＝ 3）Fig. 3 Effect of acid stress on planktonic cell count of strain ATCC43895 (n = 3)

由圖3可知，酸應(yīng)激下對(duì)照組（正常TSB）浮游菌數(shù)在2～8 h顯著增大，8 h時(shí)其浮游菌數(shù)達(dá)8.70（lg（CFU/mL）），此后至168 h基本保持穩(wěn)定。乳酸-TSB各組在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中浮游菌數(shù)均低于對(duì)照組，尤其是pH 4.0乳酸-TSB組，其浮游菌數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），從培養(yǎng)4 h起即隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，168 h時(shí)已減小至檢測(cè)限以下。pH 3.5鹽酸-TSB組的浮游菌數(shù)變化與pH 5.0乳酸-TSB組類(lèi)似。結(jié)果表明，浮游菌數(shù)顯著依賴(lài)于pH值，pH值越低，即培養(yǎng)條件酸性越強(qiáng)，浮游菌數(shù)越少；pH值相同時(shí)乳酸對(duì)浮游菌數(shù)的抑制效應(yīng)顯著高于鹽酸。

酸應(yīng)激下菌株ATCC43895生物菌膜形成情況如圖4所示。對(duì)照組（正常TSB）生物菌膜形成量逐漸增多，從2 h的3.42（lg（CFU/cm2））增長(zhǎng)至168 h時(shí)的7.03（lg（CFU/cm2））。乳酸-TSB各組和pH 3.5鹽酸-TSB組在培養(yǎng)2 h時(shí)的菌膜形成量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），表明乳酸和鹽酸顯著抑制了菌膜形成。酸應(yīng)激下形成的菌膜逐漸減少，其中pH 5.0乳酸-TSB和pH 3.5鹽酸-TSB組在培養(yǎng)120 h時(shí)形成的菌膜略微減少，pH 4.5乳酸-TSB組生物菌膜形成量緩慢增加，介于pH 5.0乳酸-TSB組和pH 4.0乳酸-TSB組之間，而pH 4.0乳酸-TSB組從培養(yǎng)8 h起即逐漸減少，直至低于檢測(cè)限。結(jié)果表明，生物菌膜形成量明顯依賴(lài)于pH值，pH值越低，即培養(yǎng)條件酸性越強(qiáng)，生物菌膜形成量越少，較長(zhǎng)時(shí)間酸處理可導(dǎo)致已形成的菌膜發(fā)生部分甚至全部消除；pH 3.5鹽酸-TSB組培養(yǎng)2 h時(shí)的菌膜形成量較少，4 h后大幅增多，至24 h時(shí)菌膜形成量接近pH 5.0乳酸-TSB組，表明pH值相同時(shí)乳酸對(duì)菌膜最終形成的抑制效應(yīng)顯著高于鹽酸。

圖4 酸應(yīng)激下菌株ATCC43895生物菌膜形成量變化Fig. 4 Effect of acid stress on biofilm formation of strain ATCC43895

2.4 酸應(yīng)激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM比較

根據(jù)2.1節(jié)和2.2節(jié)結(jié)果，進(jìn)一步選取較強(qiáng)黏附力菌株J29和一株較弱黏附力菌株CICC21530進(jìn)行生物菌膜的CLSM比較。同時(shí)根據(jù)2.3節(jié)結(jié)果，因酸性較強(qiáng)時(shí)菌膜形成較少，為了更好地觀察菌膜結(jié)構(gòu)，選取pH 5.0乳酸-TSB作為酸應(yīng)激組，以正常TSB作為對(duì)照組。

較弱黏附力菌株CICC21530在正常和酸性TSB中形成生物菌膜的CLSM圖像變化如圖5所示。培養(yǎng)24 h時(shí)可發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)條件下均開(kāi)始有少量單個(gè)菌體黏附于不銹鋼表面，培養(yǎng)72 h時(shí)正常TSB中已有少量小的細(xì)菌“團(tuán)狀物”出現(xiàn)，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體出現(xiàn)連接趨勢(shì)，但未觀測(cè)到“團(tuán)狀物”出現(xiàn)，培養(yǎng)168 h時(shí)正常TSB中的菌體連接成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較松散，且觀察到較多紅色菌體，表明死菌數(shù)明顯增加。

較強(qiáng)黏附力菌株J29在正常和酸性TSB中形成生物菌膜的CLSM圖像變化如圖6所示。培養(yǎng)24 h時(shí)可發(fā)現(xiàn)正常TSB組中已有細(xì)菌黏附體出現(xiàn)，pH 5.0乳酸-TSB組中為大量單個(gè)菌體黏附，并伴有少量細(xì)菌“團(tuán)狀物”出現(xiàn)；培養(yǎng)72 h時(shí)正常TSB中形成了復(fù)雜的細(xì)菌黏附聚集體，呈現(xiàn)密集的“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體呈現(xiàn)松散“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)168 h時(shí)正常TSB中“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)更加密集，呈“云霧狀”，而pH 5.0乳酸-TSB組與正常TSB相比，“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)較松散，無(wú)“云霧狀”形成。

通過(guò)兩種培養(yǎng)液之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩株菌均為pH 5.0乳酸-TSB組的菌膜形成明顯弱于正常TSB組，形成過(guò)程慢、菌膜形成量少、結(jié)構(gòu)較單薄，表明乳酸對(duì)菌株生物菌膜的形成具有抑制效應(yīng)。而在兩株菌之間比較發(fā)現(xiàn)，黏附力較弱的菌株CICC21530和黏附性較強(qiáng)的菌株J29形成生物菌膜的數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化明顯不同，菌株CICC21530黏附少，且成熟期“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)單薄，而J29黏附量大，且成熟期“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)更致密，表明生物菌膜的形成過(guò)程表現(xiàn)出明顯的菌株差異性。

圖5 不同pH值時(shí)菌株CICC21530生物菌膜的CLSM圖（600×）Fig. 5 CLSM images of biofilms formed by CICC21530 at different pH values (600 ×)

圖6 不同pH值時(shí)菌株J29生物菌膜的CLSM圖（600×）Fig. 6 CLSM images of biofilms formed by J29 at different pH values (600 ×)

3 討 論

食源性致病菌生物菌膜比游離菌體對(duì)食品安全的威脅更大，菌體形成成熟生物菌膜的初始步驟是黏附于接觸面[1-3]，因此本研究首先對(duì)14 株大腸桿菌O157:H7黏附性能進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)14 株菌株均能在聚苯乙烯微孔表面產(chǎn)生黏附，表明這些大腸桿菌O157:H7都具有形成生物菌膜的能力，但不同菌株菌膜形成能力存在差異。楊沁南[18]采用微孔結(jié)晶紫法評(píng)價(jià)北京市市售雞肉中的大腸桿菌黏附性能，Díez-García等[13]比較了69 株雞源沙門(mén)氏菌黏附性能，李瓊瓊[19]研究112 株金黃色葡萄球菌菌膜形成能力，均發(fā)現(xiàn)不同菌株的菌膜形成能力具有較大差異。近年對(duì)肉類(lèi)腐敗相關(guān)的腸桿菌、雞源性莓實(shí)假單胞菌的研究也發(fā)現(xiàn)不同菌株菌膜形成能力存在差異[20-21]，這與本研究結(jié)果一致。然而，Lianou等[14]研究認(rèn)為沙門(mén)氏菌生物菌膜的形成與血清型及菌株無(wú)關(guān)，這可能與各自研究中所用的測(cè)試菌株不同有關(guān)。致病菌的黏附特性應(yīng)引起高度重視，因?yàn)槭称芳庸ぴO(shè)備表面會(huì)用到類(lèi)似材質(zhì)，如分隔板、傳送帶、集裝框和包裝袋等，由于清洗消毒不完全，殘留的致病菌可發(fā)生黏附進(jìn)而形成生物菌膜，引發(fā)食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

食品加工工業(yè)中，食源性致病菌更傾向于黏附、生長(zhǎng)于食品及加工器械表面，通過(guò)形成生物菌膜以應(yīng)對(duì)外界各種不良環(huán)境的刺激[2,4]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選用中等黏附力的菌株ATCC43895為測(cè)試菌株，采用食品級(jí)不銹鋼片為黏附表面，研究在長(zhǎng)時(shí)酸應(yīng)激環(huán)境中菌膜形成能力的變化。選用乳酸和鹽酸分別作為有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸的酸應(yīng)激代表物，設(shè)置系列pH值梯度，選擇25 ℃（室溫）為培養(yǎng)溫度，在這些條件下研究大腸桿菌O157:H7的生物菌膜可獲得與實(shí)際生產(chǎn)情況更為接近的信息，為了解實(shí)際食品加工環(huán)境中致病菌生物菌膜的形成狀況提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)論是在有機(jī)酸還是無(wú)機(jī)酸環(huán)境中，菌株ATCC43895均能夠黏附在不銹鋼表面形成生物菌膜，且生物菌膜形成量顯著依賴(lài)于pH值，其中酸度較強(qiáng)的有機(jī)酸（pH 3.5乳酸）可以明顯抑制該菌株生物菌膜的形成，而在酸度相對(duì)較弱的有機(jī)酸（pH 4.5、5.0乳酸）環(huán)境中，該菌株可在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)不斷形成生物菌膜。王虎虎[22]研究沙門(mén)氏菌在酸應(yīng)激條件下生物菌膜的形成時(shí)得到了相似結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌O157:H7在較強(qiáng)的酸性環(huán)境中可在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)不斷形成生物菌膜，需要對(duì)這一結(jié)果引起重視?，F(xiàn)代食品工業(yè)中有較多食品加工體系處于酸性環(huán)境中，如酸乳生產(chǎn)、發(fā)酵香腸加工、食醋釀造等。此外，有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸作為食品添加劑、防腐劑和消毒劑也被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，尤其是當(dāng)酸性消毒劑使用后沒(méi)有被完全清洗而殘留在食品加工接觸面上時(shí)，將會(huì)給食源性致病菌提供一個(gè)弱酸性生存環(huán)境[23-25]，而在弱酸性環(huán)境中可以形成生物菌膜的食源性致病菌將會(huì)對(duì)食品安全造成極大的威脅。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株ATCC43895在相同pH值的乳酸和鹽酸環(huán)境中其黏附能力也存在顯著差異，這說(shuō)明酸種類(lèi)是影響大腸桿菌O157:H7成膜能力的關(guān)鍵因素。已有研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸對(duì)細(xì)菌存活能力的影響比無(wú)機(jī)酸更大[26]，另有學(xué)者指出，相對(duì)于無(wú)機(jī)酸而言，有機(jī)酸可以以未解離的方式進(jìn)入菌體細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放質(zhì)子，使得胞內(nèi)pH值迅速降低，從而對(duì)微生物代謝活動(dòng)起到抑制作用而達(dá)到顯著抗菌效果[27]，不同的有機(jī)酸由于未解離分子結(jié)構(gòu)不同，對(duì)大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響亦不同[23]。

隨著CLSM技術(shù)的發(fā)展，研究者對(duì)細(xì)菌生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較多探索[28-31]。本研究應(yīng)用CLSM對(duì)酸應(yīng)激下不同黏附力的2 株大腸桿菌O157:H7生物菌膜結(jié)構(gòu)變化規(guī)律進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，正常TSB培養(yǎng)液中2 種菌株均能形成一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的生物菌膜，而黏附力較弱菌株的菌膜形成量顯著少于黏附力較強(qiáng)菌株（P＜0.05），這與上述微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法觀察到的菌膜形成（圖2）結(jié)論相一致。pH 5.0乳酸條件下，菌膜仍可逐漸形成，但菌膜形成量和微觀結(jié)構(gòu)與正常TSB組相比受到明顯抑制，這與上述平板計(jì)數(shù)法觀察到的酸應(yīng)激下菌膜形成（圖4）結(jié)論相符合。pH 5.0乳酸條件下，菌株CICC21530從培養(yǎng)24 h初始黏附到培養(yǎng)72 h時(shí)呈現(xiàn)片狀、網(wǎng)狀的菌膜結(jié)構(gòu)，表明弱酸性環(huán)境中黏附性能較弱的菌株仍然能夠逐漸形成菌膜；而黏附性能較強(qiáng)菌株J29在24～72 h逐漸形成大量菌膜，至168 h時(shí)形成大量黏附聚集體，導(dǎo)致其中死亡菌體的比例大大減少，故反而不易觀察到其中的紅色死亡菌體（圖5、6）。為較好地觀察到菌膜微觀結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，本研究采用pH 5.0弱酸性條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示一定濃度乳酸能夠有效抑制大腸桿菌O157:H7生物菌膜的形成。當(dāng)然其他菌膜抑制劑應(yīng)用[31-32]或多種防控技術(shù)聯(lián)合效應(yīng)[9]值得進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

生物菌膜是食品加工中微生物交叉污染的源頭，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合食品加工實(shí)際環(huán)境探究較長(zhǎng)時(shí)間酸應(yīng)激對(duì)大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響。采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法比較14 株大腸桿菌O157:H7黏附性能差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏附性能存在明顯菌株差異。選取較強(qiáng)黏附力菌株J29，中等黏附力菌株ATCC43895和4 株較弱黏附力菌株，采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法觀察菌膜形成曲線(xiàn)，結(jié)果表明各菌株均在培養(yǎng)2 h開(kāi)始產(chǎn)生黏附，但黏附性能不同的菌株其菌膜形成曲線(xiàn)呈現(xiàn)明顯差異。選取中等黏附力菌株ATCC43895作為代表菌株，采用平板計(jì)數(shù)法觀察酸應(yīng)激對(duì)生物菌膜形成的影響，結(jié)果表明環(huán)境pH值越低，其浮游菌數(shù)和生物菌膜形成量越少，pH值相同時(shí)乳酸抑制效應(yīng)顯著高于鹽酸。CLSM發(fā)現(xiàn)黏附能力較強(qiáng)的菌株J29和較弱的菌株CICC21530在酸性和正常TSB培養(yǎng)液中均能形成一定結(jié)構(gòu)的生物菌膜，且前者的菌膜形成量多于后者，酸性條件成膜過(guò)程較正常條件（pH 7.2）時(shí)緩慢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了大腸桿菌O157:H7菌膜形成的菌株差異性，及酸應(yīng)激時(shí)菌膜形成和微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，可為酸性食品實(shí)際生產(chǎn)加工中大腸桿菌O157:H7風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論參考，并為研究致病菌生物菌膜的有效防控技術(shù)提供科學(xué)思路。