禽沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法的建立

張富友 宋艷 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孫淑紅

禽沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法的建立

張富友 宋艷 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孫淑紅*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271018）

禽沙門(mén)氏菌是常見(jiàn)的一種人畜共患病原菌，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)對(duì)于防控沙門(mén)氏菌病非常重要。傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法準(zhǔn)確，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究擬建立準(zhǔn)確快速的檢測(cè)技術(shù)。選擇疑似發(fā)生沙門(mén)氏菌病的某種雞群3個(gè)批次共計(jì)119份未出殼死胚樣品，分別經(jīng)BPW增菌，SC和TTB分別增菌后，再利用XLD鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后，利用PCR方法進(jìn)行沙門(mén)氏菌的分離鑒定。同時(shí)，所有樣品均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(國(guó)標(biāo)法)進(jìn)行沙門(mén)氏菌的分離鑒定。結(jié)果顯示，本研究建立的沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)法相比，沙門(mén)氏菌檢出率均為41.2%，吻合率100%；血清分型試驗(yàn)顯示，該49株沙門(mén)氏菌均為雞白痢沙門(mén)氏菌；本研究建立的檢測(cè)方法用時(shí)3d-6d，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法需要6d-9d。本研究表明，禽沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)技術(shù)可準(zhǔn)確、快速地完成沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，而且成本更低。該技術(shù)方法可用于種雞群沙門(mén)菌感染狀態(tài)評(píng)估和調(diào)查分析以及規(guī)模化種禽場(chǎng)沙門(mén)菌凈化，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

禽沙門(mén)氏菌 鑒別培養(yǎng) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) PCR

禽沙門(mén)氏菌病是由不同血清型的沙門(mén)氏菌引起的禽類(lèi)不同類(lèi)型傳染病的總稱(chēng)，根據(jù)病原體的抗原結(jié)構(gòu)不同可以分為雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒[1]。禽沙門(mén)氏菌在世界各地普遍存在，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害很大[2]。同時(shí)，部分血清型的沙門(mén)氏菌是人畜共患病原菌，防控禽沙門(mén)氏菌病對(duì)公共衛(wèi)生有重要意義[3]。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(國(guó)標(biāo)法)是用于禽沙門(mén)氏菌分離鑒定最常用的方法，該標(biāo)準(zhǔn)可保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是在疾病預(yù)防和疫情的應(yīng)急處理中不能夠適用。免疫學(xué)檢測(cè)方法相比傳統(tǒng)方法省時(shí)，靈敏度高，但大部分依賴(lài)設(shè)備，且對(duì)技術(shù)人員有一定的要求[4]。本研究擬簡(jiǎn)化傳統(tǒng)方法，把鑒別培養(yǎng)和PCR方法結(jié)合，既保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確和靈敏，又操作簡(jiǎn)單易行，建立適用于禽沙門(mén)氏菌快速鑒定的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 山東省某種雞群疑似發(fā)生沙門(mén)氏菌病，采集三個(gè)批次的未出殼死胚送檢，共計(jì)119份。

1.2 試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)(TTB)、碘液、0.1%煌綠、XLT4瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂(BS)均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；沙門(mén)氏菌生化鑒定管(GB)購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；沙門(mén)菌屬診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 增菌培養(yǎng) 按照GB 4789.4-2016規(guī)定進(jìn)行增菌培養(yǎng)。無(wú)菌取雞胚肝臟、部分腸段樣品，剪碎，加入BPW預(yù)增菌，37℃、220rpm/min培養(yǎng)8~ 18h；然后分別用SC培養(yǎng)基和TTB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、220rpm/min培養(yǎng)18~24h。

1.4 本研究建立的禽沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法

1.4.1 鑒別培養(yǎng) 取1.3增菌培養(yǎng)后樣品用三線(xiàn)法接種到XLD鑒別培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18~48h。

1.4.2 PCR鑒定 按照參考文獻(xiàn)[5]合成沙門(mén)氏菌通用引物FimW，由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(引物見(jiàn)表1)，優(yōu)化其PCR反應(yīng)程序[6]。從XLD培養(yǎng)基上分別挑取4~6個(gè)可疑菌落，接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用培養(yǎng)后的增菌液作為模板，進(jìn)行PCR方法檢測(cè)。

表1 FimW引物序列及片段大小

1.5 禽沙門(mén)氏菌檢測(cè)的國(guó)標(biāo)法 取1.3增菌培養(yǎng)后的樣品，按照GB 4789.4-2016規(guī)定進(jìn)行鑒別培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等檢測(cè)。

1.6 沙門(mén)氏菌分離株的血清型鑒定 按照沙門(mén)菌屬診斷血清試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 禽沙門(mén)氏菌的鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 疑似沙門(mén)氏菌的菌落形態(tài) SC和TTB選擇性增菌培養(yǎng)后，經(jīng)XLD鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，119樣品中有49樣品出現(xiàn)無(wú)色半透明菌落，疑似雞白痢沙門(mén)氏菌(圖1)。SC+XLD和TTB+XLD組合中可疑菌落比例分別為49/119和45/119。

圖1 疑似雞白痢沙門(mén)氏菌的菌落形態(tài)

2.1.2 PCR鑒定結(jié)果 用FimW引物進(jìn)行PCR鑒定結(jié)果表明，49株疑似沙門(mén)氏菌樣品均檢測(cè)為陽(yáng)性（圖2）。

圖2 部分樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 禽沙門(mén)氏菌的國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 疑似沙門(mén)氏菌的菌落形態(tài) SC和TTB選擇性增菌培養(yǎng)后，經(jīng)XLD和BS鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，119樣品中，XLD培養(yǎng)基中出現(xiàn)無(wú)色半透明菌落，BS培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色或灰色有金屬光澤的菌落，SC+XLD、SC+BS、TTB+XLD和TTB+BS 4個(gè)組合中疑似雞白痢沙門(mén)氏菌感染的比例分別為49/119、11/119、45/119和15/119國(guó)標(biāo)法共分離到49株疑似沙門(mén)氏菌菌株。

2.2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 從2.2.1中4個(gè)組合的XLD和BS培養(yǎng)基上分別挑取2個(gè)以上可疑菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果表明，大部分樣品三糖鐵瓊脂斜面呈紅色(產(chǎn)堿)，底層呈黃色(產(chǎn)酸)，部分樣品產(chǎn)氣，沒(méi)有樣品產(chǎn)H2S，大部分樣品賴(lài)氨酸呈紫紅色(陽(yáng)性)，少數(shù)呈黃色(陰性)，全部樣品蛋白胨水、尿素、氯化氫呈陰性，為A3反應(yīng)，需要補(bǔ)做ONPG。ONPG結(jié)果全部為陰性，表明該種雞群分離鑒定的49株可疑菌株全部為沙門(mén)氏菌。

2.3 禽沙門(mén)氏菌分離株的血清型鑒定結(jié)果

血清分型試驗(yàn)顯示，49株沙門(mén)氏菌O9；O12抗原凝集，為D群沙門(mén)氏菌；半固體培養(yǎng)基穿刺結(jié)果表明，全部菌株沒(méi)有生長(zhǎng)出鞭毛；結(jié)果表明，全部沙門(mén)氏菌為雞白痢沙門(mén)氏菌。

3 討論

3.1 兩種檢驗(yàn)方法的耗時(shí)比較

本研究建立的方法是通過(guò)前增菌、增菌、劃線(xiàn)培養(yǎng)、菌液PCR和血清學(xué)試驗(yàn)，耗時(shí)約3~6d，可一人獨(dú)立完成；國(guó)標(biāo)檢測(cè)通過(guò)前增菌、增菌、劃線(xiàn)培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)，耗時(shí)約6~9d時(shí)間，但是生化試驗(yàn)需要兩人操作(一人獨(dú)立完成需增加1d)。生產(chǎn)中如果只針對(duì)沙門(mén)氏菌陽(yáng)性率檢驗(yàn)，可以省去血清學(xué)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室方法大約使用3d左右的時(shí)間，國(guó)標(biāo)法則大約需要6d。綜上所述，本研究建立的方法更省時(shí)。

3.2 靈敏度、特異性的比較

實(shí)驗(yàn)室建立的方法共分到49株沙門(mén)菌，國(guó)標(biāo)法(GB 4789.4-2016)共分到49株沙門(mén)菌，二者沙門(mén)氏菌分離率一致，無(wú)差異。

3.3 資金費(fèi)用的比較

本研究建立的檢測(cè)技術(shù)更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。僅用XLD培養(yǎng)基完成鑒別培養(yǎng)[6]，而國(guó)標(biāo)法中應(yīng)用XLD和BS兩種鑒別培養(yǎng)基；同時(shí)，用優(yōu)化的PCR方法代替了國(guó)標(biāo)法的耗時(shí)費(fèi)力且成本高的生化試驗(yàn)。

3.4 操作便捷的比較

前期試驗(yàn)證明，XLD培養(yǎng)基對(duì)禽沙門(mén)氏菌分離效果比BS培養(yǎng)基好，并且分離株包含BS培養(yǎng)基中分離到的菌株、XLD培養(yǎng)基可以取代BS培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)禽沙門(mén)氏菌的分離鑒定。PCR方法更便捷，優(yōu)于生化試驗(yàn)。兩種方法中前增菌、增菌工作相同；PCR檢測(cè)需要用菌落或菌液做模板，PCR反應(yīng)完成后瓊脂糖凝膠電泳；而生化試驗(yàn)則需要準(zhǔn)備三糖鐵斜面、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，操作過(guò)程中每個(gè)樣品需要依次經(jīng)過(guò)三糖鐵斜面劃線(xiàn)和穿刺、接種賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，同時(shí)需要接種蛋白胨水、尿素瓊脂和氰化鉀培養(yǎng)基，然后根據(jù)初步判斷結(jié)果，判斷是否需要補(bǔ)做后續(xù)試驗(yàn)，該操作過(guò)程非常繁瑣，需要兩個(gè)人共同完成，中間容易出差錯(cuò)。

綜上所述，本研究建立的禽沙門(mén)氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法優(yōu)于國(guó)標(biāo)法，具有準(zhǔn)確快速、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，可作為沙門(mén)菌感染狀態(tài)評(píng)估和調(diào)查分析以及規(guī)?；N禽場(chǎng)沙門(mén)菌凈化所需的檢測(cè)技術(shù)。

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（2019–09–29）

國(guó)家十三五重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0501608）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（SD2019XM009）

S852.61+2

A

1007-1733(2019)10-0001-03