低溫脅迫對不同基因型茄子種子萌發(fā)的影響

朱宗文,吳雪霞,張愛冬,田守波,查丁石

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海 201106)

茄子(SolanummelongenaL.)別名落蘇,原產(chǎn)于印度地區(qū),在我國已有1400～1500年的栽培歷史[1-2]。我國栽培的茄子品種眾多,按照居民的栽培方式和飲食習(xí)慣的不同,在遺傳變異的基礎(chǔ)上,經(jīng)過多年的自然選擇和人工選擇,形成了形狀各異、顏色多樣、軟硬度差異明顯的眾多茄子生態(tài)類型,具有廣泛的地域性特征。至今在我國的西部偏遠(yuǎn)地區(qū)還有一些茄屬野生種,這些野生種大多較當(dāng)前栽培品種生長勢強,抗逆性強,可以作為優(yōu)良的育種資源[3]。茄子作為一種喜溫性蔬菜,對低溫敏感性較強。其植株生長發(fā)育的適宜溫度為22～30 ℃,低于15 ℃時植株生長緩慢,低于5 ℃時莖葉受到傷害,0 ℃以下就會被凍死[4]。在低溫脅迫下,茄子幼苗生長受到抑制,光合作用效率降低[5],植株受到氧化傷害[6],最終茄子的產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。隨著栽培設(shè)施和栽培技術(shù)的不斷改進,人們對保護地茄子生產(chǎn)的要求越來越高,對耐低溫性品種的需求也越來越迫切。目前,國內(nèi)相關(guān)科研單位和種子公司很少有耐低溫的保護地專用茄子品種[7-8],而其他茄果類蔬菜像番茄[9]和辣椒[10-11]有較多的保護地低溫專用品種的介紹。在低溫條件下茄子生產(chǎn)主要還是通過嫁接這一途徑來實現(xiàn)[12]。因此,選育出耐低溫性強的保護地專用茄子品種極其重要。我們以本課題組長期保存和積累的各種類型的茄子高代自交系材料為研究對象,通過觀察在不同低溫條件下種子的萌發(fā)情況,對低溫脅迫下不同基因型茄子材料種子的耐低溫性做出評價,希望為茄子耐低溫性鑒定及耐低溫材料的篩選提供依據(jù),為茄子低溫育種材料的創(chuàng)制提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

10份供試茄子材料(表1)為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所茄子課題組保存的高代自交系材料。經(jīng)過預(yù)實驗驗證，同一批種子的發(fā)芽率一致,整齊度高。

表1 供試茄子品種/材料的情況

1.2 低溫處理

將不同類型的茄子材料種子分別置于發(fā)芽盒中,在發(fā)芽紙上加入適量蒸餾水后分別放入設(shè)定不同溫度的人工智能培養(yǎng)箱進行低溫處理,溫度設(shè)定分別為10、15、20、25 ℃。

1.3 種子萌發(fā)測定

用透明塑料發(fā)芽盒(12 cm× 12 cm× 5 cm)測定種子的萌發(fā)情況。將種子放入鋪有兩層發(fā)芽紙的發(fā)芽盒中,置于不同溫度培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。每個溫度處理100粒種子,3次重復(fù)。從第2天起逐日統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)。以第14天作為發(fā)芽結(jié)束時間,發(fā)芽結(jié)束后統(tǒng)計各項發(fā)芽指標(biāo)。相關(guān)發(fā)芽指標(biāo)的計算公式為:發(fā)芽率(Gr)=∑Gt/NT×100%;相對發(fā)芽率=處理種子的Gr/對照種子的Gr;發(fā)芽勢=規(guī)定時間內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑(Gt/Dt);活力指數(shù)(Vi)=Gi×S。其中,Gt表示在t日時的發(fā)芽數(shù),Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；NT表示種子總數(shù)；S表示發(fā)芽終期幼苗的高度(cm)。

1.4 幼苗冷害指數(shù)和恢復(fù)能力的測定

幼苗冷害指數(shù)和恢復(fù)能力的測定參照王孝宜等[13-14]的方法(作了適當(dāng)改進)。將發(fā)芽結(jié)束后的幼苗繼續(xù)在人工智能培養(yǎng)箱中進行低溫處理7 d,每日向發(fā)芽盒中加入適量的蒸餾水,保證發(fā)芽紙濕度適中;7 d后,統(tǒng)計幼苗的冷害指數(shù)CI。全部死亡時統(tǒng)計CI為最大值1,全部正常時統(tǒng)計CI為最小值0。統(tǒng)計結(jié)束后，將幼苗全部移到正常溫度的培養(yǎng)箱進行1周的恢復(fù)培養(yǎng),結(jié)束后統(tǒng)計幼苗的恢復(fù)能力，恢復(fù)能力以恢復(fù)正常的幼苗數(shù)占總幼苗株數(shù)的百分比表示。對每一幼苗的冷害癥狀進行分級:0級，無冷害癥狀;1級，僅子葉邊緣有輕度皺縮萎蔫;2級，子葉大部分區(qū)域變色萎蔫;3級，子葉整體萎蔫;4級，整株死亡。冷害指數(shù)(CI)=(1×S1+2×S2+3×S3+4×S4+0×S0)÷(低溫脅迫總株數(shù)×4)。式中,Si(i=0,1,2,3,4)為相應(yīng)冷害等級的苗數(shù)。

1.5 統(tǒng)計方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件和Excel對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、作圖及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對不同類型茄子種子發(fā)芽率的影響

不同類型茄子種子經(jīng)低溫處理后,各溫度處理間種子發(fā)芽率存在很大的差異性(表2)。其中1、5、8號三個基因型種子在10 ℃和15 ℃溫度條件下均不發(fā)芽,在20 ℃條件下發(fā)芽率也較低且顯著低于正常溫度下的;4號和7號種子在10 ℃下不發(fā)芽,在15 ℃下發(fā)芽率極低;2號和6號種子在15 ℃下的發(fā)芽率顯著高于在20 ℃下的;3、6和10號種子在10 ℃下不發(fā)芽,在15 ℃下發(fā)芽率較高且與正常溫度下差異不顯著;9號種子是唯一在10 ℃低溫條件下還可以發(fā)芽的,且在15 ℃和20 ℃條件下發(fā)芽很好，與正常溫度下無明顯差異?？傮w來看：9號發(fā)芽最好,發(fā)芽耐低溫性最強;其次是3號、6號和10號;發(fā)芽耐低溫性較差的是1號、5號和8號。

表2 不同低溫處理對茄子種子發(fā)芽率的影響

注:同一列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母代表在不同溫度處理間存在顯著差異(P<0.05)。下同。

2.2 不同低溫處理對茄子種子發(fā)芽勢的影響

發(fā)芽勢反映了發(fā)芽初期種子活力的強弱和發(fā)芽的整齊度。經(jīng)低溫處理后,各類型茄子的發(fā)芽勢呈現(xiàn)出很大差異性(表3)。發(fā)芽勢最高的是9號，它是唯一在10 ℃低溫條件下具有發(fā)芽勢的茄子品種,其在15 ℃和20 ℃條件下發(fā)芽勢與對照無顯著性差異;6號在15 ℃下的發(fā)芽勢與對照無顯著差異,并顯著高于在20 ℃下的發(fā)芽勢;10號在20 ℃下的發(fā)芽勢與對照無顯著差異;其他類型茄子種子的發(fā)芽勢隨著溫度下降均顯著低于前一溫度梯度下的發(fā)芽勢。綜合發(fā)芽率和發(fā)芽勢可以看出：9號不僅發(fā)芽率在低溫條件下較高,發(fā)芽整齊度也很好,15 ℃的低溫對其發(fā)芽勢無顯著影響；6號和10號的發(fā)芽勢表現(xiàn)出一定的整齊度,但是總體上弱于9號;1、2、4、5、8號的發(fā)芽勢在各低溫條件下表現(xiàn)較弱,在正常溫度條件下也較弱,這說明發(fā)芽整齊度與其本身的基因類型和種子存貯狀況存在一定的關(guān)系。

表3 不同低溫處理對茄子種子發(fā)芽勢的影響

2.3 不同低溫處理對茄子種子發(fā)芽指數(shù)的影響

經(jīng)低溫處理后,不同類型茄子種子呈現(xiàn)出不同的發(fā)芽速率,我們測定其發(fā)芽指數(shù)來衡量其發(fā)芽速率。從表4中可以看出：在10 ℃條件下,只有9號存在發(fā)芽指數(shù),并與其它溫度條件下存在顯著性差異,而在15、20、25 ℃處理間其發(fā)芽指數(shù)不存在顯著性差異;3號在20 ℃條件下的發(fā)芽指數(shù)與對照無顯著性差異,在15 ℃下與正常溫度下存在顯著性差異;6號在15 ℃和20 ℃下的發(fā)芽指數(shù)沒有顯著性差異,但與對照存在顯著性差異;其它各類型種子的發(fā)芽指數(shù)隨溫度降低與前一溫度梯度均呈現(xiàn)出顯著性差異。

表4 不同低溫處理對茄子種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.4 不同低溫處理對茄子種子活力指數(shù)的影響

如表5所示：9號茄子幼苗具有最強的活力指數(shù),其在10 ℃下活力指數(shù)很低,在其他3種溫度處理間也存在顯著性差異,但總體活力指數(shù)最高;2號的活力指數(shù)在10 ℃和15 ℃條件下差異不顯著,是所有實驗品種中唯一一個在不同溫度梯度間活力指數(shù)差異不顯著的;其他各實驗品種的活力指數(shù)在不同溫度處理間均呈現(xiàn)出顯著性差異,說明環(huán)境低溫對其活力指數(shù)下降產(chǎn)生了顯著影響。

2.5 不同低溫處理對茄子種子萌發(fā)幼苗冷害指數(shù)的影響

經(jīng)低溫處理的種子萌發(fā)后,將幼苗繼續(xù)進行7 d的低溫生長觀測，測定各類型茄子幼苗的冷害指數(shù)。從圖1中可以看出：9號在各個低溫條件下冷害指數(shù)最低,是所有實驗品種中最耐低溫的;2號和10號在15 ℃條件下具有一定的耐低溫性；1號、5號和8號在15 ℃條件下不發(fā)芽或幼苗完全死亡;在20 ℃條件下各品種的冷害指數(shù)較低,5號和8號受影響較大。綜合來看,9號最耐低溫,10號、2號次之,5號和8號最不耐低溫。

表5 不同低溫處理對茄子種子活力指數(shù)的影響

圖1 低溫處理后各類型茄子幼苗受冷害情況

2.6 不同低溫處理對幼苗恢復(fù)能力的影響

將經(jīng)低溫處理的各類型幼苗移入正常溫度下進行幼苗恢復(fù)能力的測定。從圖2可以看出：在10 ℃條件下只有9號的幼苗具有一定的恢復(fù)能力;經(jīng)15 ℃處理后,6號和9號幼苗的恢復(fù)能力超過50%,而4號的恢復(fù)能力最低，在25%左右;經(jīng)20 ℃低溫處理后,各品種幼苗的恢復(fù)能力較強,只有4號低于50%;1號、5號和8號由于其種子在10 ℃和15 ℃下不發(fā)芽，因而沒有存活幼苗。從幼苗的恢復(fù)情況可以看出，9號的耐低溫性最強,6號和10號次之,1、4、5和8號最差。

圖2 低溫處理后各類型茄子幼苗的恢復(fù)情況

3 討論

當(dāng)植物受到低溫脅迫時,在各種環(huán)境信號傳導(dǎo)物質(zhì)作用下植株體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)。這些生理生化反應(yīng)是植株本身對逆境一種自我保護的應(yīng)激反應(yīng),更多是存在于生理生化物質(zhì)的積累和代謝上[15-17]。張曉艷等研究表明,在所有受低溫脅迫的茄子嫁接苗中,耐低溫材料的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均高于不耐低溫材料的[18]。吳雪霞等發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫處理后茄子幼苗的丙二醛(MDA)含量顯著增加,葉片的SOD、POD、CAT、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性均顯著升高,且其脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著增加[19]。董愛玲等研究發(fā)現(xiàn)低溫馴化顯著增加了茄子幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白含量，提高了SOD、POD、CAT活性[20]。這些研究結(jié)果均表明茄子在低溫脅迫下,其植株體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),且在不同的品種材料之間,變化存在較大差異。因而選育耐低溫性強的茄子材料對茄子育種及了解相關(guān)基因的功能有著極其重要的作用。本實驗通過對大量的高代自交系茄子材料進行低溫種子活力測定,從中找到了一些萌發(fā)耐低溫性較強的材料，其中9號表現(xiàn)最為突出，在各種溫度梯度下,其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均表現(xiàn)出很高水平,甚至在10 ℃低溫條件下仍然有部分種子可以成功發(fā)芽且幼苗具有較強的活力和恢復(fù)能力，可以作為今后茄子耐低溫育種的優(yōu)良高代自交系材料。

種子活力主要受自身基因遺傳性、種子發(fā)育成熟度和貯藏環(huán)境因子三方面的影響[21]。自身的遺傳性決定了種子活力強度的可能性,其他環(huán)境因素也會對種子活力最終的表現(xiàn)起到重要的作用。我們可以采取一定的措施來促使種子表現(xiàn)出其強的活力,有研究表明預(yù)冷處理可以有效地破除一些種子的生理休眠,如麥類種子發(fā)芽前放入濕潤的發(fā)芽床上,在5～10 ℃下處理3 d,可以達到破除生理休眠的效果[22]；喬海明發(fā)現(xiàn)用5 ℃處理野豌豆種子可以顯著提高其種子活力[23];憨宏艷等研究表明不同土壤濕度條件下低溫處理會增強水青樹種子的發(fā)芽率,并對種子活力起到一定的促進作用[24]。這些研究都表明在環(huán)境低溫條件下,種子活力受到了正面影響,這可能是由其遺傳物質(zhì)的特異性所決定的。種子萌發(fā)是一個極其復(fù)雜的過程,不僅涉及到各種貯藏物質(zhì)的分解，還涉及到許多萌發(fā)過程中相關(guān)基因的調(diào)控。白雪等以冷敏感作物蓖麻為實驗材料,構(gòu)建15 ℃(低溫)和25 ℃(適溫)兩種萌發(fā)條件下完全展開的子葉cDNA文庫,利用Illumina測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq),篩選出了低溫上調(diào)差異表達基因243個[25]。包崇來等從大量茄子育種材料中選出了耐低溫基因型材料E659,其幼苗在4 ℃低溫下處理10 d后仍能保持正常的生長狀態(tài),沒有受到明顯傷害[26]。本實驗中2號和6號茄子材料在15 ℃條件下表現(xiàn)出了較強的耐低溫能力,其發(fā)芽率、發(fā)芽勢均顯著高于20 ℃條件下的；9號材料則在15 ℃和20 ℃溫度下表現(xiàn)出了和對照一致的種子活力,并在10 ℃低溫條件下仍然表現(xiàn)出了較強的種子活力。這些表明不同基因型材料的特定遺傳物質(zhì)決定了其耐低溫能力的強弱。目前對茄子的耐低溫生理機制研究較多,但獲得極耐低溫茄子基因型材料的報道較少。本實驗為茄子耐低溫抗性種質(zhì)資源的創(chuàng)制和耐低溫新品種的選育提供了新的基因源,可作為茄子耐低溫分子育種的新材料。