細胞毒理學(xué)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

李兵霞，王友升*

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048)

細胞毒理學(xué)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

李兵霞，王友升*

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048)

細胞毒理學(xué)是研究外源性物質(zhì)對生命細胞損傷作用規(guī)律及其機制的一門毒理學(xué)分支學(xué)科，它可以用于食品安全毒理學(xué)的評價、食品中有害物質(zhì)的毒作用機理研究、食品加工生產(chǎn)中有毒有害物質(zhì)的檢測、功能性食品中功效成分的活性研究等。細胞毒理學(xué)的研究方法有多種，用于探討外源物對細胞的不同作用，包括對細胞的活性影響和遺傳學(xué)影響、造成細胞形態(tài)學(xué)變化以及細胞凋亡檢測。目前在食品領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的細胞毒理學(xué)方法有MTT比色實驗、細胞DNA合成測定法、彗星電泳法、Western blot法、流式細胞術(shù)測定法、NRU染色法、免疫細胞化學(xué)染色技術(shù)等。

細胞毒理學(xué)；食品領(lǐng)域；方法

利用動物實驗完成對有毒物的毒理學(xué)安全性評價是普遍采用的評價方法，但是隨著實驗數(shù)據(jù)的積累，人們發(fā)現(xiàn)并非所有的動物實驗都能準確地預(yù)示有害物對人體的危害，卻需要犧牲許多的動物，這樣從經(jīng)濟和科學(xué)的角度考慮，人們利用離體的動物細胞和人的細胞、組織培養(yǎng)等新的研究手段，使選擇體外方法替代動物實驗成為可能，歐洲很早就提議檢測化學(xué)物質(zhì)安全性時除非沒有可靠的替代方法才可用動物實驗[1]，這不僅是動物權(quán)益保護的需要，也彰顯著科學(xué)的進步、社會經(jīng)濟的發(fā)展。在1959年有人提出3R原則即“替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化( refinement)”原則，要善待活著的動物、減少動物死亡的痛苦，從而科學(xué)、合理、人道地使用動物[2]；國際組織，如：經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)、歐洲替代方法驗證中心(European Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)、 美國機構(gòu)間替代方法評價協(xié)調(diào)委員會(the United States Interagency Coordinating Committee for the Validation of Alternative Methods，ICCVAM)等促進了動物替代法的發(fā)展[3]，對動物替代法的相關(guān)實驗進行了驗證，OECD還建立了指導(dǎo)性體外替代實驗原則Good Laboratory Practice(GLP)[4]，它們共同推動了實驗指南的建立和實驗條件的國際一體化。毒理實驗動物替代法包括基于電腦模擬的方法和體外實驗方法[5]，目前動物替代法主要包括細胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和胚胎培養(yǎng)3種方法，其中細胞培養(yǎng)的發(fā)展成就了細胞毒理學(xué)這門學(xué)科的興起，細胞毒理學(xué)的定義是研究外源性物質(zhì)對生命細胞損傷作用規(guī)律及其機制的一門毒理學(xué)分支學(xué)科[6]，人們已經(jīng)建立很多細胞系用于細胞毒理學(xué)實驗研究，例如利用肝細胞系檢測外源物的毒性等[7]。細胞毒理學(xué)已經(jīng)用于食品領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域、植物組織栽培等，本文著重介紹細胞毒理學(xué)及其研究方法在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用研究。

1 細胞毒理學(xué)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍

目前，細胞毒理學(xué)已經(jīng)在食品領(lǐng)域的研究中有較為廣泛的應(yīng)用。細胞毒理學(xué)利用離體培養(yǎng)的細胞不僅可以研究毒物對靶細胞的毒性及其毒物在細胞中的生物轉(zhuǎn)化，而且還可以研究毒物對靶細胞的作用機制，因此利用細胞毒理學(xué)能夠評價食品的安全性，檢測食品中毒素類物質(zhì)、金屬元素、農(nóng)藥殘留、添加劑及食品加工中有毒有害物質(zhì)等，并探討它們對細胞的毒效應(yīng)及作用機制[8-9]。國內(nèi)外已經(jīng)有許多學(xué)者進行了相關(guān)的研究，例如汝少國等[10]以Caco-2細胞緊密連接和PC12細胞乙酰膽堿酯酶活性為指標，建立了采用哺乳動物細胞系Caco-2和PC12細胞檢測有機磷農(nóng)藥細胞毒性的新方法，為食品毒理學(xué)在農(nóng)藥殘留中的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。隋海霞等[11]使用CHO、CHL細胞利用細胞毒理學(xué)實驗中性紅染色法等對杜仲的毒性進行了快速篩選，獲得了杜仲屬于無毒性物質(zhì)的結(jié)論。Winkler等[12]利用酶聯(lián)免疫吸附測定實驗研究了食品防腐劑亞硫酸鈉和山梨酸對外周血單核細胞的作用，Maier等[13]則用同樣的細胞毒理學(xué)實驗方法研究了食品防腐劑安息香酸鈉和丙酸以及著色劑姜黃素對外周血單核細胞的作用，前者結(jié)果表明亞硫酸鈉和山梨酸可以抑制受刺激的外周血單核細胞中色氨酸的降解和新喋呤的生成，原因是Th1-類型免疫反應(yīng)受到抑制，后者的結(jié)果也顯示所研究的食品添加劑能夠抑制Th1-類型免疫反應(yīng)從而作用于外周血單核細胞的代謝。

此外細胞毒理學(xué)也可被用來檢測功能性食品及其有效活性成分，例如研究食品當中抑癌因子的機制、檢測其對癌細胞的抑制活性，Anajwala 等[14]研究了龍舌蘭的甲醇提取物、棗檳榔的水提取物、馬錢子的甲醇提取物對癌細胞的藥理作用，受試細胞是人類MCF-7胸腺癌細胞和Vero細胞系，結(jié)果表明棗檳榔的水提取物和龍舌蘭的甲醇提取物對癌細胞有強烈的細胞毒性，而馬錢子的甲醇提取物沒有明顯的毒性效應(yīng)。揭國良等[15]用MTT等方法研究了普洱茶的不同提取物對人胚肺成纖維細胞的作用，細胞已經(jīng)做過高糖作用處理，結(jié)果表明普洱茶乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物中的某些組分對高糖作用下的人胚肺成纖維細胞具有保護作用。

2 細胞毒理學(xué)在食品領(lǐng)域中的研究方法

細胞毒理學(xué)實驗的研究方法有很多種，最為成熟也是在實際當中被很多研究者應(yīng)用的方法是MTT法，例如用于研究枸杞多糖、番茄紅素、莪術(shù)油等對癌細胞的抑制作用[16-18]，該方法可以檢測細胞活性，但這只是細胞毒理學(xué)研究中的一個方面，它需要用多種方法來探討外源物質(zhì)對細胞的不同作用，包括對細胞的遺傳學(xué)影響、造成細胞形態(tài)學(xué)變化以及細胞凋亡檢測等。細胞毒理學(xué)的研究方法有很多種，但它們研究發(fā)展的完善程度不一樣，在實際研究當中并非所有方法都得到了廣泛應(yīng)用，本文著重介紹目前被國內(nèi)外實驗人員較廣使用于食品領(lǐng)域中的細胞毒理學(xué)實驗方法。

2.1 MTT比色實驗

MTT比色實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT是顯色劑噻唑藍的簡稱，化學(xué)名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽，MTT能被活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色結(jié)晶物甲臜，沉積在細胞中，而死細胞則不能。該方法很成熟，許多研究者均利用該實驗檢測細胞的活力。飲用水中砷含量高時容易引起砷中毒， Bredfeldt[19]利用MTT等體外實驗研究了膀胱癌的致癌物三價砷和亞甲基砷酸對人尿道上皮細胞的作用，結(jié)果顯示亞甲基砷酸比砷(三價)的毒性大20倍，且人尿道上皮細胞可以將砷(三價)生物轉(zhuǎn)化為五價和三價的亞甲基化代謝物。食品中的霉菌毒素會對人體健康造成極大的威脅，例如赭曲霉毒素A(OA)產(chǎn)生于曲霉菌屬和青霉菌屬，能夠污染大米、小麥、咖啡、玉米等農(nóng)作物，動物攝入后其肝臟、腎臟會受到侵害，嚴重時可致畸。Mwanza等[20]就用了MTT方法檢測了OA對人和豬淋巴細胞的細胞毒性效應(yīng)。雖然MTT比色實驗的應(yīng)用較為廣泛，但并非可以用于所有物質(zhì)的研究，例如黃酮類中某些物質(zhì)就不能利用該方法探究其對各種細胞的作用，Peng等[21]通過其實驗研究指出在活細胞不存在時毛地黃黃酮、槲皮黃酮也可以減少MTT，這樣就會影響這兩種黃酮類物質(zhì)作用于細胞增長的測定結(jié)果。

2.2 細胞DNA合成測定法

DNA是細胞遺傳的基本物質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)中有4種堿基，其中胸腺嘧啶核苷(TdR)是其特有的堿基。因此用3H-TdR作為DNA合成的前體摻入DNA合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DNA的代謝和細胞增殖的情況。細胞DNA合成測定法可用于研究外源物質(zhì)對細胞DNA合成的影響，從而闡明它們對細胞的毒性效應(yīng)。共軛亞油酸cis-9，trans-11CLA是具有生理活性的一種天然產(chǎn)物，它可以抗動脈硬化、提高免疫力、抗癌等作用，Liu 等[22]利用細胞DNA合成測定法等細胞毒理學(xué)實驗方法研究了cis-9，trans-11CLA對乳腺癌細胞MCF-7的細胞毒性作用，結(jié)果表明cis-9，trans-11CLA可以阻斷細胞周期從而抑制MCF-7細胞的生長和增殖。環(huán)孢菌素A是由一種真菌產(chǎn)生的具有生理活性的代謝產(chǎn)物，它是一種理想的免疫抑制治療劑，Marionnet等[23]在其研究中有對環(huán)孢菌素A的免疫抑制評價，比較了用DNA合成測定法和其他方法評價環(huán)孢菌素A對正常人體皮膚角化細胞和轉(zhuǎn)染HPV病毒角化細胞的抗增生效應(yīng)，DNA合成測定法反應(yīng)了在實驗后期16～18h的細胞合成DNA的數(shù)量。

2.3 慧星電泳法(SCGE)

在細胞凋亡時，內(nèi)源性Mg2+、Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶被激活，對DNA的切割有3種形式，即小體間DNA鏈的斷裂、大分子DNA鏈的斷裂及DNA單鏈的斷裂?？捎糜谑称?、藥品、化妝品的蘆薈中含有退黑激素(MT)，它是一種吲哚類激素，能夠抗氧化、防衰老、有助于免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等作用，Bagchi等[24]利用了電泳法等細胞毒理學(xué)實驗方法研究了褪黑素對巨噬細胞J774A.1細胞的作用，該研究中巨噬細胞J774A.1細胞由于樟腦丸的誘發(fā)引起氧化應(yīng)激和DNA損傷，結(jié)果表明褪黑素對受到樟腦丸損害的巨噬細胞J774A.1細胞具有保護作用。該方法還可以用于檢測致癌物的細胞毒性作用， Uhl等[25]評估了電泳法檢測遺傳毒性致癌物對Hep G2肝癌細胞系的毒作用，他們總共檢測了12種化合物的毒效應(yīng)，這些化合物包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃樟油精等，還有一些吡啶類化合物，結(jié)果顯示有10種化合物致使DNA遷移顯著增加，該文的作者還將其所得結(jié)果與早期的相關(guān)實驗進行了比較，表明Hep G2/SCGE方法用于預(yù)測基因毒性是很有前景的。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot法)

Western blot法是分析細胞蛋白質(zhì)表達的一種生物學(xué)技術(shù)，它是將電泳分離的非標記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對蛋白質(zhì)進行鑒定及定量的方法。利用該方法可以研究外源物對細胞中遺傳物質(zhì)的毒性效應(yīng)。柚皮素是一種天然的苦味物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗動脈粥樣硬化等作用，Park等[26]運用了Western blot法以及其他細胞毒理學(xué)實驗方法，研究柚皮素對癌細胞MCF-7的細胞毒作用，結(jié)果表明柚皮素抑制MCF-7細胞的強弱依賴于本身劑量的大小，作者綜合多種方法探討柚皮素的抑癌作用機理，柚皮素能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性活性氧(ROS)產(chǎn)生，活化p38、SAPK/JNK/1/2、c-Jun的信號途徑，p38、SAPK/JNK/1/2、c-Jun在細胞激素和氧化應(yīng)激下能夠造成細胞生長遏制以及細胞凋亡，同時柚皮素降低了誘導(dǎo)細胞生長的因子P-Erk1/2水平。漆葉富含黃酮類物質(zhì)，常常被用作食品添加劑和抗菌藥劑，從漆葉中提取的黃酮類物質(zhì)(RCMF)能夠抑制人體骨肉瘤細胞的生長并誘導(dǎo)其死亡，Kook等[27]對此進行了機理研究，方法包括Western blot、MTT等毒理學(xué)實驗，RCMF誘導(dǎo)人體骨肉瘤細胞凋亡與p-53介導(dǎo)的線粒體應(yīng)激反應(yīng)以及與因子AIF和EndoG的細胞核轉(zhuǎn)運有關(guān)，AIF和EndoG是誘導(dǎo)細胞凋亡的相關(guān)因子，它們的轉(zhuǎn)運又受到Bcl-2、Bax、細胞色素c的影響，而RCMF能夠通過誘導(dǎo)p53降低Bcl-2的水平、活化Bax、造成細胞色素c的釋放，最終RCMF可以誘導(dǎo)人體骨肉瘤細胞凋亡。

2.5 流式細胞術(shù)測定法

流式細胞術(shù)在食品工業(yè)當中已經(jīng)是用于檢測食品微生物的一種非常有用的工具，它可以通過同時檢測膜完整性和酶活、膜電勢、呼吸活性、胞內(nèi)pH值等來研究微生物細胞，在食品微生物中主要用于測定微生物菌群的活力和細胞計數(shù)、腐敗菌和病原菌污染的檢驗、益生菌的活力檢測等[28]，Veal等[29]也在其文獻中闡述了將細胞流式術(shù)及熒光染色用于檢測微生物細胞，包括監(jiān)測水、食物和飲料中的微生物。流式細胞術(shù)還可以用于檢測功能食品中活性成分對人體細胞的作用。長鏈多不飽和脂肪酸存在于很多植物當中，它有多種生理活性功能，在食品當中多作為營養(yǎng)強化劑，Mukaro等[30]運用流式細胞術(shù)的檢測方法研究了食用添加ω-3長鏈多不飽和脂肪酸的強化食品后，人體中紅細胞膜脂質(zhì)中長鏈多不飽和脂肪酸的變化是否間接參與抗炎癥的作用，即與有助于抗炎的白血球數(shù)量和功能改變是否相關(guān)。除此外，還可以用于檢測食品中有害因子對機體細胞的毒害作用，例如Lag等[31]利用了流式細胞術(shù)以及其他毒理學(xué)實驗研究了鎘誘導(dǎo)原生上皮肺細胞死亡的作用機理，該研究指出鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡與p53和Bax有關(guān)，不涉及氧化代謝途徑。

2.6 其他方法

在食品領(lǐng)域研究中常見的方法還包括中性紅攝取(neutral red uptake，NRU)細胞毒理學(xué)實驗和免疫細胞化學(xué)染色技術(shù)。NRU實驗在許多研究當中被用來檢測外源物對細胞生活力的影響，人們用此方法可以研究食品中活性成分的功效、食品中有害因子的細胞毒效應(yīng)以及食品添加劑對機體細胞的毒性作用等。例如Jeong等[32]利用NRU、MTT等細胞毒理學(xué)實驗，研究了山茶葉的水提取物對神經(jīng)元細胞PC12的保護作用，Handrich等[33]利用該方法檢測了未知霉菌毒素對機體細胞的毒性效應(yīng)，Vaucher 等[34]就研究了殺菌劑多肽P40對綠猴腎細胞的毒效應(yīng)。

免疫細胞化學(xué)染色是把血清學(xué)方法和顯微示蹤方法結(jié)合起來的一類技術(shù)，根據(jù)標記物的種類不同，可分為免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)、免疫酶細胞化學(xué)技術(shù)、免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫金-銀細胞化學(xué)技術(shù)、親和免疫細胞化學(xué)技術(shù)及放射免疫自顯影法等。該技術(shù)可以研究細胞的形態(tài)學(xué)變化以及胞內(nèi)代謝物，已有國內(nèi)外的學(xué)者將其用在食品領(lǐng)域中的研究，例如Weaver等[35]利用免疫細胞化學(xué)染色技術(shù)探究了致癌物苯對上皮肺癌細胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)及作用機理，林明華等[36]用免疫酶染色法和MTT法，研究了從苦參根等植物中提取的生物活性成分氧化苦參堿對小鼠皮膚成纖維細胞NIH3T3增殖及Ⅰ型膠原合成的影響。

3 結(jié) 語

我國傳統(tǒng)的食品安全性毒理學(xué)評價是利用動物進行的體內(nèi)實驗，這樣費時、費力、費財，而隨著實驗動物使用的4Rs (減少、替代、優(yōu)化和可靠) 原則的倡導(dǎo)與實施，毒理學(xué)替代法成為有價值的研究新手段，所以細胞毒理學(xué)這門在毒理學(xué)研究領(lǐng)域中衍生出的新興學(xué)科，在食品毒理學(xué)安全性評價中的研究與應(yīng)用越來越受到人們的青睞和關(guān)注。細胞毒理學(xué)作為動物活體實驗的替代法之一，在食品領(lǐng)域的相關(guān)研究具有很好的發(fā)展前景。

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Application of Cytotoxicology in Food Industry: A Review

LI Bing-xia，WANG You-sheng*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Cytotoxicology has been used to study the actions and mechanisms of exogenous substances on the damage of living cells. It can be applied to assess food safety, study the mechanisms of toxicity, detect hazardous substances in food processing and examine functional food ingredients. Currently, cytotoxicologic methods such as MTT colorimetric assay, DNA synthesis assay, comet electrophoresis, Western blot method, flow cytometry assay, NRU staining, immunocytochemical staining are being applied in food industry.

cytotoxicology；food industry；methods

R994.4

A

1002-6630(2011)17-0384-04

2011-06-27

北京市科技新星項目(2007B011)；北京市屬高等學(xué)校人才強教計劃資助項目(PHR201108082)

李兵霞(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：lilanhaoyang@126.com

*通信作者：王友升(1976—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wangys@th.btbu.edu.cn