醒腦靜對大鼠腦出血病灶周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)水通道蛋白-4的影響研究*

趙志靖，第五飛虎，鄧毅恒，楊利孫

長安醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710016)

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是嚴(yán)重危及廣大人民健康與生活的臨床常見危重病與多發(fā)病，其繼發(fā)性腦水腫是明顯影響患者轉(zhuǎn)歸的重要因素之一[1]。基礎(chǔ)和臨床研究提示，醒腦靜能促進(jìn)腦出血后患者蘇醒，縮短昏迷時間，減少并發(fā)癥發(fā)生，目前其機(jī)制仍未明確[2]。水通道蛋白-4(AQP-4)主要分布在腦組織，分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜等，在維持大腦水平衡發(fā)揮重要作用，目前國內(nèi)外極少探討醒腦靜相互作用與其機(jī)制如何的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)旨在利用動物與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共同探討醒腦靜對大鼠腦出血病灶周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)AQP-4的作用效果，以期進(jìn)一步闡明醒腦靜減輕腦出血動物模型腦水腫的原理，為臨床應(yīng)用提供參考。

材料和方法

1 材 料 成年雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量(250±30)g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(軍) 2012-0007]。醒腦靜注射液(國藥準(zhǔn)字Z32020563)購自無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司。大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株(R1800)購自上海中喬新舟生物科技有限公司。AQP-4抗體(兔抗鼠)購自美國ABCAM公司，山羊抗兔二抗、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國THERMO FISHER公司?？俁NA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國PROMEGA公司。胎牛血清、丙酮酸鹽溶液、DMEM培養(yǎng)基均購自美國THERMO FISHER公司。

2 研究方法

2.1 動物模型的建立與分組:參考文獻(xiàn)所述方法[3]，采用膠原酶VII定位注射誘發(fā)大鼠尾殼核腦出血模型。實(shí)驗(yàn)前一周實(shí)驗(yàn)大鼠均接受平衡木訓(xùn)練。使用異氟烷氣體麻醉大鼠，固定于立體定位儀，暴露實(shí)驗(yàn)鼠前囟后1 mm，正中線旁開3 mm處(尾殼核定位處)鉆開顱骨，微量注射器注射0.6 U膠原酶VII/3 μl生理鹽水，深度為5 mm，注射速度為1 μl/min。注射后停留10 min退針。術(shù)后6 h后用Longa FZ評分法進(jìn)行行為學(xué)評分，具體如下：0分，無體征；1分，不能完全伸展進(jìn)針對側(cè)肢體(左側(cè))；2分，進(jìn)針對側(cè)肢體癱瘓，向進(jìn)針對側(cè)轉(zhuǎn)圈，有追尾現(xiàn)象；3分，不能站立向進(jìn)針對側(cè)傾倒；4分，有意識障礙。評分達(dá)2分以上加上病理學(xué)證據(jù)可認(rèn)為模型成功。造模失敗補(bǔ)齊動物并重新造模。

將造模成功大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為醒腦靜治療組與對照組，給藥方法如下：分組后給藥一次，醒腦靜治療組大鼠給予腹腔注射醒腦靜注射液2 ml/kg，對照組大鼠給予腹腔注射等容量生理鹽水。治療72 h后予以處死取材，處死前進(jìn)行行為學(xué)評分，兩組各隨機(jī)選組20只大鼠腦實(shí)質(zhì)組織提取總蛋白或總RNA后至于-70℃冰箱保存，其余均用來作腦含水量測定。

2.2 行為學(xué)觀察:參考文獻(xiàn)所述方法，利用平衡木評分法對治療72 h后兩組大鼠進(jìn)行評估，以其觀察兩組大鼠行為學(xué)變化。讓大鼠通過升高的平衡木，進(jìn)入較暗的飼養(yǎng)箱。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，能跳上平衡木，在上面行走不會跌倒；1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機(jī)會少于50%；2分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機(jī)會大于或等于50%；3分，在健側(cè)后肢的幫助下能跳上平衡木，但受累癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動；4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分，將大鼠放在平衡木上會掉下來。3次測試結(jié)果的平均分作為最后成績。

2.3 腦實(shí)質(zhì)含水量測定：采用干濕質(zhì)量法，術(shù)后48 h即處死兩組大鼠進(jìn)行取材，首先將兩組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織完整組織稱濕重，然后放入恒溫電烤箱內(nèi)，上調(diào)溫度至120℃，持續(xù)8 h，稱取干質(zhì)量。利用公式：腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%進(jìn)行計算。

2.4 腦實(shí)質(zhì)組織學(xué)觀察:制備常規(guī)標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察；制備電鏡標(biāo)本，經(jīng)半薄切片定位制成超薄切片，在透射電鏡下觀察。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:細(xì)胞株(R1800)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)液)置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞貼壁90%時，用胰酶進(jìn)行消化傳代。首先調(diào)整細(xì)胞密度，實(shí)驗(yàn)前24 h，按照密度1.5×105/cm2接種細(xì)胞到預(yù)先包被多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)板，15 min后將上清去掉，更換為新鮮含血清培養(yǎng)基，并置于環(huán)境調(diào)節(jié)為37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育培養(yǎng)。分組處理：①5 ml/L醒腦靜組，培養(yǎng)基中添加5 ml/L醒腦靜注射液；②10 ml/L醒腦靜組，培養(yǎng)基中添加10 ml/L醒腦靜注射液；③20 ml/L醒腦靜組，培養(yǎng)基中添加20 ml/L醒腦靜注射液；④對照組，單純含體積分?jǐn)?shù)的10%FBS。培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，提取總蛋白或總RNA后至于-70℃冰箱保存。

2.6 蛋白免疫印跡:將實(shí)驗(yàn)中提取的組織或細(xì)胞蛋白以100 g/L SDS-PAGE電泳分離，行轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉，分別加入AQP-4(兔抗，1∶1000)，冰箱4℃行孵育。過夜后，進(jìn)行徹底洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶2500)孵育2 h，再次進(jìn)行洗膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析，以β-actin為內(nèi)參。

2.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR:將提取的組織或細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，以該cDNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測AQP-4的轉(zhuǎn)錄水平，以β-actin為內(nèi)參。引物由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科實(shí)驗(yàn)設(shè)計，由上海生工公司合成。

結(jié) 果

1 兩組大鼠生存率、行為學(xué)評分及腦實(shí)質(zhì)含水量的差異 對照組大鼠死亡8只，生存率為73.33%，醒腦靜治療組大鼠死亡例數(shù)為2只，生存率為93.33%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。平衡木行為學(xué)評分法對兩組大鼠行為學(xué)進(jìn)行評價，對照組評分為(4.60±0.34)分，醒腦靜治療組評分為(2.63±0.39)分，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如圖1所示，所有大鼠造模后均顯示腦實(shí)質(zhì)尾狀核出血。對照組大鼠腦組織含水量(80±0.510)%，醒腦靜治療組大鼠腦組織含水量(77±0.351)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2 兩組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的差異 兩組大鼠腦組織常規(guī)HE染色，光鏡下可見兩組大鼠腦實(shí)質(zhì)中可見血腫，且血腫周圍組織腫脹，細(xì)胞呈氣球樣變、壞死，炎性細(xì)胞浸潤以中性粒細(xì)胞為主。相對于對照組，醒腦靜治療組間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。透射電鏡觀察顯示，對照組大鼠腦實(shí)質(zhì)中星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，呈氣球樣變，胞質(zhì)疏松分散，細(xì)胞器減少，細(xì)胞核增大，可見部分細(xì)胞核體腫脹，少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為壞死，醒腦靜治療組均未發(fā)現(xiàn)類似表現(xiàn)(圖2)。

3 兩組大鼠腦實(shí)質(zhì)AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)的差異 醒腦靜治療組大鼠腦組織AQP-4蛋白表達(dá)量顯著高于對照組表達(dá)量，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣，醒腦靜治療組大鼠腦組織AQP-4 mRNA表達(dá)量顯著高于對照組表達(dá)量，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05圖3)。

4 醒腦靜對星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)AQP-4蛋白及mRNA的影響 相對于對照組，5 ml/L醒腦靜可上調(diào)AQP-4蛋白及mRNA的表達(dá)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著醒腦靜濃度遞增，AQP-4蛋白及mRNA的表達(dá)也呈現(xiàn)遞增，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05圖4)。

討 論

由于血腦屏障的破壞，腦出血后首先出現(xiàn)的為血管源性腦水腫，隨著細(xì)胞代謝障礙，繼發(fā)出現(xiàn)的細(xì)胞毒性腦水腫起主導(dǎo)作用，最終導(dǎo)致顱內(nèi)壓明顯升高危及患者生命。目前研究認(rèn)為，炎癥因子釋放、激活相應(yīng)的信號通道與腦出血后病灶周圍組織水腫的發(fā)生密切相關(guān)[4-7]。醒腦靜注射液屬于中成藥，是由安宮牛黃丸所改成的水溶性的注射液，主要有麝香、郁金、冰片等中藥成分提取而成。已有的研究表明醒腦靜對于清除血腦屏障及自由基，尤其對患者血清中的腫瘤壞死因子、白介素-6、白介素-8等炎癥因子具有抑制作用，從而達(dá)到保護(hù)腦水腫區(qū)域腦細(xì)胞的重要作用[8]。本研究采用膠原酶VII定位注射誘發(fā)大鼠尾殼核腦出血模型，給模型大鼠腹腔分別注射醒腦靜與等容量的生理鹽水，造模72 h后，醒腦靜治療組大鼠生存率為93.33%，明顯高于對照組，經(jīng)醒腦靜治療后的腦出血大鼠在肢體對稱平衡方面也得到改善，醒腦靜治療組評分為(2.63±0.39)分，對照組評分為(4.60±0.34)分，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在光鏡下，相對于對照組，醒腦靜治療組間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。透射電鏡觀察顯示，對照組大鼠腦實(shí)質(zhì)中星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，呈氣球樣變，胞質(zhì)疏松分散，細(xì)胞器減少，細(xì)胞核增大，可見部分細(xì)胞核體腫脹，少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為壞死，醒腦靜治療組均未發(fā)現(xiàn)類似表現(xiàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，醒腦靜治療可減輕腦出血后周圍組織腦水，提高模型大鼠的生存率，改善模型大鼠肢體對稱平衡。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的細(xì)胞，它參與血腦屏障的構(gòu)成，在腦實(shí)質(zhì)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系密切，研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在血管源性腦水腫的發(fā)生、發(fā)展以及消退中起重要作用[9-12]。腦組織中水通道蛋白主要為AQP-4，其在腦內(nèi)主要集中在腦室系統(tǒng)的室管膜、腦表面的軟腦膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，是星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ赖鞍?，調(diào)節(jié)腦脊液重吸收、腦細(xì)胞滲透壓水平等，在維持大腦水平衡發(fā)揮重要作用[13-14]。目前研究顯示，若AQP-4基因被敲除，即可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生血管源性腦水腫[15-16]。腦出血后首先表現(xiàn)的為血管源性腦水腫，本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腦組織表達(dá)AQP-4mRNA及蛋白均明顯下降，同樣支持AQP-4功能缺失參與血管源性腦水腫的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示，醒腦靜通過刺激模型組大鼠腦實(shí)質(zhì)AQP-4mRNA及蛋白的表達(dá)，減輕腦出血后腦水腫的程度，從而改善模型大鼠的生存率及肢體對稱平衡。

腦出血后血腦屏障破壞，滲出到血管外的血液成分、凝血酶、血清等均參與血管源性腦水腫的形成。目前研究發(fā)現(xiàn)，含血清培養(yǎng)可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞水腫。在本研究中發(fā)現(xiàn)，加入10%FBS后，在倒差顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)呈氣球樣變，細(xì)胞胞體增大，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞核增大，甚至部分細(xì)胞核核體腫脹破裂。培養(yǎng)基中加入醒腦靜注射液，倒差顯微鏡下觀察可見星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，破裂細(xì)胞核明顯減少。進(jìn)一步蛋白免疫印跡及逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，隨著加入培養(yǎng)基中醒腦靜濃度增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯上升，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，顯示醒腦靜可通過上調(diào)AQP-4表達(dá)，緩解細(xì)胞水腫的發(fā)展，然而其具體誘導(dǎo)途徑尚需進(jìn)一步深入研究。

綜述所述，本研究采用膠原酶VII定位注射誘發(fā)大鼠尾殼核腦出血模型，證實(shí)了經(jīng)醒腦靜治療后的腦出血大鼠無論在生存率還是在肢體對稱平衡方面均得到改善，其機(jī)制可能是醒腦靜可直接刺激星形細(xì)胞上調(diào)AQP-4蛋白及mRNA的表達(dá)，從而緩解腦出血后血管源性腦水腫的進(jìn)展，這為未來醒腦靜用于治療腦出血后腦水腫治療提供新的理論支持。