外周血淋巴細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)和意義

鄭小娟 段亞男 溫鴻雁 李小峰

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性炎癥性疾病，發(fā)生率為0.5%～1.0%，女性和老年人發(fā)生率較高[1]。目前病因未明確，認(rèn)為免疫失衡在其發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)是CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)重要亞群。Th17細(xì)胞分泌IL-17，在人類和小鼠中IL-17具有促炎作用，且與許多炎癥相關(guān)，而Treg則具有抑制炎癥的作用，并參與了維持自身環(huán)境的免疫耐受。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)RA患者外周血淋巴細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群的表達(dá)情況，并探討其在RA發(fā)生、發(fā)展中的意義。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:137例RA患者均為2017年5月～2018年8月筆者所在科室住院患者，其中，男性34例，女性103例；患者年齡14～86歲，平均年齡51±13歲；病程0.05～38.00年，平均病程7±8年。其診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)1987年的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重腎臟、血液系統(tǒng)、心臟、肝臟及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病患者；消化道疾病患者。要求納入觀察組的患者無(wú)干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織病等免疫疾病或影響免疫的相關(guān)疾病。同時(shí)收集50例來(lái)筆者醫(yī)院健康體檢者為健康對(duì)照組，其中，男性8例，女性42例；年齡20～66歲，平均年齡42±14歲。病例組和對(duì)照組的年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.研究方法：采集137例RA患者及50例正常人外周血，并收集它們的所有臨床資料，包括性別、年齡、病程，用流式細(xì)胞儀技術(shù)(FCM)檢測(cè)正常人和患者外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)。山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科實(shí)驗(yàn)室為該課題提供數(shù)據(jù)。

3.主要設(shè)備及試劑:采用美國(guó)BD公司提供的 FACS Calibur流式細(xì)胞儀。淋巴細(xì)胞檢測(cè)使用試劑：?jiǎn)慰寺】贵w CD3/CD8/CD45/CD4；CD3/CD16+56-/CD45/CD19；Trucount 管(內(nèi)部含有數(shù)量可知的Beads)；FACS Lysing Solution(溶血素)(10×，使用前用蒸餾水稀釋成1×)；CD4+T細(xì)胞亞群檢測(cè)使用試劑：離子霉素、胎牛血清、1640液、高爾基阻斷劑、刺激素PMA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。單克隆抗體CD4-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-APC、IL-17-PE、CD25-APC、FoxP3-PE購(gòu)自美國(guó)BD公司。

4.淋巴細(xì)胞檢測(cè):兩支Trucount管順序分別編號(hào)A和B；將50μl盡量混勻的抗凝全血倒入到Tube中(使用的方法是反向加樣法)；另外再取 CD3FITC/CD8PE/CD45PercP/CD4APC抗體20μl加入到A管中；取 CD3FITC/CD16+56-PE/CD45 PercP/CD19APC抗體20μl加入到B管中。渦旋混勻，室溫避光放置15～20min。將450μl 1×FACS溶血素倒入其中，均勻混合，室溫避光靜置15min。24h內(nèi)將A、B管放入檢測(cè)儀上，在MultiSET軟件上抽取15000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。上機(jī)前應(yīng)充分混勻。

5.Th細(xì)胞亞型標(biāo)記:(1)Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞培養(yǎng)與標(biāo)記:在刺激劑10μl PMA工作液(終濃度30ng/ml)、10μl Ionomycin工作液(終濃度750ng/ml)和1μl GolgiStop中分別加入80μl抗凝血，調(diào)整CO2培養(yǎng)箱溫度在37℃，并刺激上述試劑5h。將細(xì)胞分成A管和B管，將抗人CD4-FITC分別倒入A管和B管，在沒(méi)有光照的室溫下培育30min后，將配置不久的Fixation/Permeabilization液1ml分別倒入各管渦旋攪勻，4℃避光孵育30min后，將IL-4-PE和IFN-γ-APC加入A管，將抗人IL-17-PEB倒入B管。(2)Treg細(xì)胞標(biāo)記:將CD4-FITC和CD25-APC分別加入80μl抗凝血，室溫避光孵育30min后，A、B管分別加入新鮮配置的Fixation/Permeabilization液1ml渦旋混勻，4℃避光孵育30min后，加入抗人FOXP3抗體，在沒(méi)有光照的室溫下培育30min后，PBS清洗，上機(jī)測(cè)試。(3)流式細(xì)胞儀測(cè)定:24h內(nèi)上流式細(xì)胞儀(Calibur, 美國(guó)BD公司)，并用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定分析結(jié)果。根據(jù)對(duì)淋巴細(xì)胞設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，該區(qū)分采用的是前向角散射光(FSC)及對(duì)側(cè)向角散色光(SSC)的散點(diǎn)圖，區(qū)分Th細(xì)胞(CD4+)的方法是通過(guò)CD4對(duì)SSC設(shè)門，選擇門內(nèi)10000個(gè)細(xì)胞，以CellQuest軟件取得、分析相應(yīng)百分?jǐn)?shù)，并推算出絕對(duì)數(shù)量。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；數(shù)值變量不服從常態(tài)分布，采用中位數(shù)(四分位數(shù))法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；兩樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.RA與健康人淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較：RA患者Th細(xì)胞明顯高于健康對(duì)照組、NK細(xì)胞明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)[個(gè)/微升，M(P25，P75)]

2.RA患者與健康組CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較：除Th17細(xì)胞外，其Th1、Th2、Treg、Th1/Th2、Th17/Treg與健康對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

3.早期RA與非早期RA淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較：非早期RA患者總T明顯低于早期RA患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

4.早期RA與非早期RA患者CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較：非早期RA患者Th17細(xì)胞明顯低于早期RA患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

表2 兩組外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)[個(gè)/微升，M(P25，P75)]

表3 兩組外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)[個(gè)/微升，M(P25，P75)]

表4 兩組外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)[個(gè)/微升，M(P25，P75)]

5.外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較：初治組、復(fù)治組與健康對(duì)照組CD4+T細(xì)胞亞群比較，Th1、Th2、Th1/Th2、Th17/Treg均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表5。

表5 3組外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的比較[個(gè)/微升，M(P25，P75)]

6.不同疾病活動(dòng)分層中，Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的變化：在低活動(dòng)組和中活動(dòng)組中Th17細(xì)胞絕對(duì)數(shù)高于健康對(duì)照組，其中3.2

表6 不同疾病活動(dòng)分層Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的變化[個(gè)/微升，M(P25，P75)]

討 論

RA是一種慢性自身免疫性疾病,盡管發(fā)病機(jī)制不明確,但已認(rèn)識(shí)到RA與機(jī)體免疫功能相關(guān)。研究表明Th/Ts細(xì)胞的平衡，在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。此外NK細(xì)胞存在RA患者的滑膜液中，被認(rèn)為在骨破壞中起重要作用[2]。本研究結(jié)果顯示，RA患者Th細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中所占的絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯高于正常人，說(shuō)明Th細(xì)胞參與RA疾病的發(fā)病。并且NK細(xì)胞在外周血中所占的絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯低于正常人。究其原因，有研究指出，NK細(xì)胞功能與運(yùn)動(dòng)之間有一定聯(lián)系，包括血運(yùn)、缺氧和體溫調(diào)節(jié)對(duì)NK細(xì)胞功能的影響[3]。由此可知，可能是多種因素導(dǎo)致RA中NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量及功能降低，進(jìn)而影響其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而不完全是RA疾病本身所導(dǎo)致的數(shù)量減少。

另有研究表明，CD4+T細(xì)胞亞群中Th1、Th2等異常在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。以前多數(shù)認(rèn)為RA是由Th1驅(qū)動(dòng)的疾病，Th1細(xì)胞與炎癥有關(guān)，而Th2細(xì)胞在一定程度上有抗炎作用。有實(shí)驗(yàn)對(duì)RA縱向研究發(fā)現(xiàn)，在RA早期的PBMCs中，Th2反應(yīng)占主導(dǎo)地位，而長(zhǎng)期慢性RA表現(xiàn)出Th1占主導(dǎo)反應(yīng)[5]?？芍猅h1或Th2反應(yīng)是否在RA中占主導(dǎo)作用可能取決于多種因素，包括患者年齡、RA分期(早期或晚期)以及病情所在位置(PBMCs或滑膜液)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA患者Th1細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞所占的絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，該結(jié)果與陳俊偉等[6]的研究結(jié)果相近，說(shuō)明Th1細(xì)胞在RA疾病的發(fā)病中起到一定的作用。Th2細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞所占的絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯低于健康對(duì)照組，且Th1/Th2在外周血淋巴細(xì)胞所占的比例明顯高于健康對(duì)照組，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Th1、Th2與RA發(fā)病均有一定的相關(guān)性，且Th1/Th2失衡在RA的發(fā)病起關(guān)鍵作用。

有研究認(rèn)為Th17來(lái)源的細(xì)胞因子通過(guò)誘導(dǎo)IL-6、GM-CSF、IL-8等來(lái)吸引不同類型細(xì)胞，尤其是IL-17A和IL -17F是參與RA發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵細(xì)胞因子，此外，Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-21促進(jìn)B細(xì)胞分化為產(chǎn)生自身抗體的漿細(xì)胞，并以自分泌方式放大Th17細(xì)胞反應(yīng)[7]。

本研究顯示，RA患者Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)比健康對(duì)照組高，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與賈瑞環(huán)等[8]的研究結(jié)果相一致。某種程度上說(shuō)明Th17細(xì)胞在RA中起到的作用有限。Liu等[9]從大鼠淋巴細(xì)胞檢測(cè)Th17/Treg細(xì)胞比例，與對(duì)照組比較，大鼠關(guān)節(jié)炎Treg細(xì)胞表達(dá)水平明顯下降，IL-17表達(dá)水平明顯升高，本研究結(jié)果與該研究結(jié)果相矛盾。盡管許多研究結(jié)果不全相同，但普遍認(rèn)為Th17細(xì)胞某種程度上參與RA疾病進(jìn)展。也有研究顯示，STAT3 對(duì)Th17 細(xì)胞分化有著關(guān)鍵的作用，上調(diào)STAT3促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，下調(diào)STAT3抑制Th17細(xì)胞分化，由此可以通過(guò)影響STAT3誘導(dǎo)Th17細(xì)胞向有利的方向分解[10, 11]。

與Dong等[12]的研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果也證實(shí)了RA患者外周血Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)比正常人明顯降低，且Th17/Treg比值比健康對(duì)照組明顯升高，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少及功能降低是造成RA發(fā)病的關(guān)鍵因素，且Th17/Treg平衡紊亂在RA的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在人類中,Th17細(xì)胞可以誘導(dǎo)IL-6、IL-1β和TNF-α，所有這些在活動(dòng)性RA患者發(fā)炎的關(guān)節(jié)中都很多,并直接參與軟骨和骨的破壞[13]。雖然通常認(rèn)為Th1和Th17細(xì)胞在RA的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，Evans等[14]進(jìn)一步研究報(bào)道，體內(nèi)自發(fā)激活了從RA患者炎癥關(guān)節(jié)中提取的CD14+單核細(xì)胞，并特異性誘導(dǎo)Th17，而非Th1或Th2反應(yīng)?？芍赗A患者中增多的Th17細(xì)胞激活同時(shí)受體內(nèi)自身因素影響。

有研究顯示，在體外骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)抑制小鼠CD4+T細(xì)胞IL-17表達(dá)，上調(diào)FOXP3表達(dá)[15]。體內(nèi)注射MDSCs可明顯改善炎癥性關(guān)節(jié)炎。經(jīng)MDSCs處理的小鼠脾臟Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞減少，Treg增加，提示MDSCs可能是治療自身免疫性疾病的有效策略。通過(guò)不同方式調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡將成為糾正免疫穩(wěn)態(tài)的重要途徑。

本研究顯示，非早期RA患者外周血總T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯低于早期RA患者，說(shuō)明非早期RA患者免疫力更低，隨著疾病進(jìn)展，淋巴細(xì)胞在外周血中的絕對(duì)數(shù)明顯減少，表明非早期RA患者更容易發(fā)生感染。而非早期RA患者Th17細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯低于早期RA患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其一可能與RA患者長(zhǎng)期使用DMARDS藥物治療導(dǎo)致免疫抑制的結(jié)果，其二也可能與RA的分期(早期或非早期)以及病情所在的位置(PBMCs或滑膜液)相關(guān)聯(lián)。同時(shí)本研究對(duì)59例初治RA患者、78例復(fù)治RA患者與50例健康人比較，發(fā)現(xiàn)Th17/Treg細(xì)胞比值較健康人明顯升高，提示初治患者及使用DMARDS藥物治療的復(fù)治患者均存在免疫失調(diào)，間接反應(yīng)出長(zhǎng)期使用DMARDS藥物治療不能很好地控制疾病進(jìn)展。

為尋找更好的治療方案，Jhun等[16]研究顯示，二甲雙胍和輔酶Q10聯(lián)合應(yīng)用減少關(guān)節(jié)炎癥、Th17分化和IgG生成，誘導(dǎo)Treg分化，降低破骨細(xì)胞生成，且二者的結(jié)合促進(jìn)了線粒體O2的消耗，二甲雙胍和輔酶Q10聯(lián)合使用可降低CIA的嚴(yán)重程度，改善線粒體功能障礙，該研究為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了新的治療策略。此外，本研究將137例RA患者根據(jù)疾病活動(dòng)度進(jìn)行分層，分為低活動(dòng)組、中活動(dòng)組、高活動(dòng)組，發(fā)現(xiàn)隨著疾病活動(dòng)度的增高，在低活動(dòng)組和中活動(dòng)組中Th17細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，同時(shí)Th17/Treg在DSA28≤3.2組及3.2

綜上所述，Th17/Treg細(xì)胞可能在RA的發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用，但它們之間的相互抑制、相互作用的關(guān)系，仍不明確，有待于今后進(jìn)一步研究。