剪接體蛋白SmD3在果蠅S2細胞中對U2A的影響

欒曉瑾 顏一丹 陳 霞 謝 冰 鄭倩雯 王 敏 陳萬銀 喬 晨 于 駿 方 杰

真核生物細胞核內(nèi)DNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生未經(jīng)修飾的前體mRNA(pre-mRNA)后，需要在剪接體(spliceosome)的作用下去除內(nèi)含子，連接外顯子，才能成為成熟的mRNA分子。剪接體由5種細胞核糖核蛋白小體(small nuclear ribonucleoprotein, snRNP)包括U1、U2、U4、U5和U6 snRNPs，以及100多種蛋白質(zhì)因子組成[1,2]。Sm蛋白是高度保守的RNA結(jié)合蛋白家族，真核生物中主要分為經(jīng)典Sm蛋白和類Sm蛋白(like Sm, LSm)，由7種經(jīng)典Sm蛋白質(zhì)B/B′、D1、D2、D3、E、F和G所形成的七聚體環(huán)是剪接體上與大多數(shù)snRNP結(jié)合的基本結(jié)構(gòu)，只有U6 snRNP與LSm2-8七聚環(huán)結(jié)合[3，4]。SmD3作為經(jīng)典Sm蛋白之一，對于pre-mRNA的剪接至關(guān)重要，然而仍不清楚SmD3是否具有剪接因子除外的其他功能[5]。

UAS-Gal4系統(tǒng)是一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，最早在果蠅中建立，已成功利用Gal4于多種果蠅組織中激活UAS下游靶基因[6]。有研究通過UAS-Gal4系統(tǒng)進行大規(guī)模果蠅睪丸RNA干擾(RNAi)篩選，共鑒定了包括SmD3在內(nèi)的221個參與生殖干細胞自我更新過程的調(diào)控因子，具體調(diào)控機制尚未明確[7]。近期研究表明，U2 snRNP的關(guān)鍵組成蛋白U2A具有新功能，它是雄性果蠅生育力所必需的，果蠅睪丸生殖細胞缺乏U2A導致未分化的精原細胞積累[8]。尚未有文獻報道U2A與SmD3是否存在相互作用。

果蠅S2細胞為果蠅胚胎細胞，由于其基因組可整合多拷貝的質(zhì)粒，表達外源蛋白的效率較高，已經(jīng)作為體外實驗細胞模型逐漸廣泛運用于生物學及醫(yī)學領域的研究[9,10]。因此，本研究通過SmD3 siRNA及構(gòu)建pUAS-attB-SmD3表達載體，借助果蠅S2細胞為表達系統(tǒng)實現(xiàn)SmD3表達水平的改變，利用qRT-PCR檢測U2A mRNA表達，同時應用免疫熒光法對U2A進行蛋白水平的檢測，以探索SmD3對U2A的影響，為研究SmD3的作用機制提供方向。

材料與方法

1.材料：S2細胞從果蠅基因組資源中心獲得；Schneider培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列Bioind公司)；SmD3 CDS 由浙江大學佟超實驗組惠贈；U2A抗體由南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學國家重點實驗室惠贈；帶熒光標記的SmD3 siRNA質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒(蘇州吉瑪基因公司)；Xhol Ⅰ、Xbal Ⅰ、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR用SYBRGreen染料(日本TaKaRa公司)；Oligo-fectamineTM2000試劑(美國Invitrogen公司)；Effectene Transfection Reagent(德國Qiagen公司)；Opti-MEM(美國Gibco公司)；Cy3標記抗兔IgG(H+L)(美國Jackson公司)；qRT-PCR引物(上海生工生物公司)；Real-timePCR儀：Mx3000P/Mx3005P(美國Agilent公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)。

2.構(gòu)建SmD3過表達克?。簩mD3 CDS通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增添加Xhol Ⅰ和Xbal Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點。上游引物序列：5′-CCGCTCGAGGTATGTCTATCGGAGTGCCCAT-3′，下游引物序列：5′-GCTCTAGATTTCTACAGGCCGCCGCGTCCT-3′。其反應條件為：95℃、30min，95℃、10s，55℃、30s，72℃、40min，共38個循環(huán)；72℃、7min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收電泳產(chǎn)物，使用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物予以純化。用Xhol Ⅰ和Xbal Ⅰ對上步所提取質(zhì)粒及pUAS-attB表達載體進行雙酶切。將酶切產(chǎn)物進行純化后，將回收的插入片段與載體連接，熱轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中，涂布于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，所提取質(zhì)粒用Xhol Ⅰ/Xbal Ⅰ雙酶切予以驗證，并送予上海生工生物工程公司測序比對。

3.S2細胞培養(yǎng)：S2細胞常規(guī)培養(yǎng)采用Schneider培養(yǎng)基，補以10%胎牛血清。S2細胞培養(yǎng)在28℃無CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)其生長狀態(tài)，按一定比例每3天傳代1次。實驗前將S2細胞接種在6孔板上，加入1.5ml含10%胎牛血清的Schneider培養(yǎng)基，待細胞生長直至密度達約80%時進行轉(zhuǎn)染。

4.敲減SmD3基因：操作按脂質(zhì)體Oligo-fectamineTM2000試劑說明書進行。分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋SmD3 siRNA和轉(zhuǎn)染試劑，以150nmol/L濃度進行轉(zhuǎn)染。48h后行qRT-PCR觀察結(jié)果以篩選出干涉效率較高的siRNA序列進行后續(xù)實驗。siRNA信息描述詳見表1。

表1 siRNA序列

5.過表達SmD3基因：使用Effectene Transfection Reagent試劑進行SmD3瞬時轉(zhuǎn)染實驗。每孔共轉(zhuǎn)染0.8μg質(zhì)粒，將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒和6.4μl Enhancer混合，用buffer EC補足至100μl，振蕩混勻，靜置5min。然后加入20μl Effectene Transfection Reagent顛倒混勻，以形成DNA-脂質(zhì)體復合物。最后，加入600μl Opti-MEM，混勻后加入細胞中，培養(yǎng)48h。詳細的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒如下：對照組為ub-Gal4+pUAS-attB；SmD3 過表達組為ub-Gal4+pUAS-attB-GFP+pUAS-attB-SmD3。

6.免疫熒光染色檢測U2A蛋白的表達：將上述步驟中培養(yǎng)24h的S2細胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行免疫熒光實驗。用4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定20min，用含0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的PBS清洗3次，每次10min，用5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉30min，加入兔抗U2A抗體于室溫孵育1h后再用含0.1% TritonX-100的PBS清洗3遍。再用二抗在室溫孵育1h，最后用含0.1% TritonX-100的PBS清洗，去除多余的二抗，用100μl 1.0mg/ml的Hoechst33342染DNA 15min后，用80%甘油封片。S2細胞免疫熒光圖片通過熒光顯微鏡采集，每幅圖像取3個不同視野，并根據(jù)像素及熒光強度利用進行熒光強度定量分析。

7.qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后S2細胞SmD3 mRNA表達水平：將培養(yǎng)48h的各組S2細胞采用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計測量RNA濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。SYBR熒光染料、cDNA、引物用來配制PCR反應體系。反應條件為95℃、2min；95℃、15s，60℃、20s，共40個循環(huán)。Ct值應用2-ΔΔCt方法處理，每個基因的相對表達量按照內(nèi)參的表達量進行標準化處理。詳細的引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物

結(jié) 果

1.SmD3 siRNA干涉效率驗證：在S2細胞中以150nmol/L濃度分別轉(zhuǎn)染SmD3 siRNA-1、SmD3 siRNA-2干擾片段后，熒光顯微鏡檢測可觀察到FAM發(fā)出的綠色熒光信號(圖1A)，通過計算FAM陽性細胞比例，表明轉(zhuǎn)染效率為(25.330±2.556)%(圖1B)。qRT-PCR結(jié)果表明，各siRNA轉(zhuǎn)染組SmD3 mRNA相對表達水平有不同程度的下調(diào)，以SmD3 siRNA-1的轉(zhuǎn)染組下調(diào)最為明顯，可下調(diào)約70%(圖1C)，因此選擇SmD3 siRNA-1進行后續(xù)的實驗。

2.SmD3 siRNA在果蠅S2細胞中對U2A表達水平的影響：免疫熒光結(jié)果顯示(圖2A)，與對照組比較，SmD3 siRNA-1組的U2A蛋白熒光信號強度增強(2.177±0.197 vs 9.988±0.473)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，表明U2A蛋白表達水平增高(圖2B)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，SmD3 siRNA-1組的U2A mRNA相對表達水平上調(diào)約20%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，見圖2C。

圖1 SmD3 siRNA轉(zhuǎn)染效率及干涉效率驗證A.siRNA片段FAM熒光基團表達情況(×400)，F(xiàn)AM(綠色)，DNA(藍色)，標尺30μm;B.FAM陽性細胞所占比例; C.對照組和SmD3 siRNA組細胞中SmD3 mRNA的相對表達水平，*P=0.000

圖2 敲減SmD3導致S2細胞內(nèi)U2A表達水平升高A.對照組和SmD3 siRNA-1組進行免疫熒光染色(×400)，U2A(紅色)，DNA(藍色)，標尺30μm；B.對照組和SmD3 siRNA-1組中U2A蛋白熒光信號強度柱狀圖；C.對照組和SmD3 siRNA-1組細胞中 U2A mRNA的相對表達水平

3.成功構(gòu)建pUAS-attB-SmD3克隆并在S2細胞中實現(xiàn)SmD3過表達：根據(jù)SmD3 CDS序列,設計了1對含有Xhol Ⅰ和Xbal Ⅰ酶切位點的引物，進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物克隆至pUAS-attB載體中，獲得重組質(zhì)粒pUAS-attB-SmD3，經(jīng)限制性內(nèi)切酶驗證和克隆片段的測序、對比，證實了克隆片段的可靠性，具體流程詳見圖3。在ub-Gal4驅(qū)動下，于果蠅S2細胞中同時表達pUAS-attB-GFP與pUAS-attB-SmD3。熒光顯微鏡檢測可觀察到pUAS-attB-GFP自發(fā)的綠色熒光信號(圖4A)，通過計算GFP陽性細胞比例，表明轉(zhuǎn)染效率為(22.070±0.706)%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000,圖4B)。培養(yǎng)兩天后進行qRT-PCR實驗，圖4C結(jié)果顯示SmD3 mRNA相對表達水平上調(diào)至對照組20倍以上。

4.SmD3過表達在果蠅S2細胞中對U2A表達水平的影響：免疫熒光結(jié)果顯示(圖5A)，與對照組比較，SmD3過表達組的U2A蛋白熒光信號強度減弱(2.725±0.062 vs 1.286±0.044)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，表明U2A蛋白表達水平降低，見圖5B。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，SmD3過表達組的U2A mRNA相對表達水平下調(diào)約50%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，見圖5C。

圖3 構(gòu)建pUAS-attB-SmD3克隆的流程

圖4 SmD3基因過表達轉(zhuǎn)染效率及SmD3 mRNA相對表達水平A.pUAS-attB-GFP熒光蛋白表達情況(×400)，GFP(綠色)，DNA(藍色)，標尺30μm;B.GFP陽性細胞所占比例；C.對照組和SmD3過表達組細胞中SmD3 mRNA的相對表達水平

圖5 過表達SmD3基因?qū)е耂2細胞內(nèi)U2A表達水平下降A.對照組和SmD3過表達組進行免疫熒光染色(×400)，U2A(紅色)，DNA(藍色)，標尺30μm；B.對照組和SmD3過表達組中U2A蛋白熒光信號強度柱狀圖；C.對照組和SmD3過表達細胞中U2A mRNA的相對表達水平

討 論

剪接體是一個高度動態(tài)的分子機器，在真核生物進化中具有保守性，對于真核生物維持正常的生命活動至關(guān)重要，也是蛋白質(zhì)分子多樣性產(chǎn)生的機制之一[11,12]。pre-mRNA的剪接是真核生物基因表達的關(guān)鍵一步，剪接體功能異常將導致嚴重的后果，許多人類疾病都歸咎于基因的錯誤剪接或剪接體的錯誤調(diào)控，例如地中海貧血、白血病和乳腺癌等[13,14]。

剪接體的裝配過程是復雜有序的，細胞質(zhì)中的運動神經(jīng)元生存蛋白(survival motor neuron，SMN)復合體和經(jīng)過對稱二甲基化修飾的Sm/LSm蛋白結(jié)合共同形成SMN-Sm復合體，接著細胞核內(nèi)小分子RNA(U snRNA),包括U1、U2、U4、U5和U6 snRNAs。通過其Sm位點保守序列(AUUUUUG)與SMN-Sm復合體結(jié)合，形成剪接體snRNPs的共同結(jié)構(gòu)域，最后裝配完成的snRNPs在細胞核轉(zhuǎn)入受體的作用下，轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)與pre-mRNA結(jié)合，并在其他多種蛋白因子的參與下，完成剪接過程[15,16]。

剪接體的許多組成部分已經(jīng)被證明具有新功能，與果蠅生殖細胞自我更新與分化有密切的關(guān)系。SmB和SmD3是oskar信使核糖核蛋白(mRNP)的特異性組分，而oskar mRNP合適的定位是果蠅卵母細胞分化及成熟所必需的[17]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)在剪接體裝配過程中對富含精氨酸和氨基乙酸殘基的序列區(qū)的Sm蛋白(SmD3、SmB/B′、LSm4)進行對稱二甲基化修飾，PRMT5缺失將導致果蠅卵子發(fā)生過程受阻[18]。剪接體因子Prp22、Prp38通過影響卵子發(fā)生早期支持細胞中染色質(zhì)的擴散，導致染色體形態(tài)受損，影響卵子發(fā)生過程[19]。而剪接體成分U2A則已被證實具有調(diào)控果蠅精原細胞分化的功能[8]。

果蠅S2細胞是優(yōu)于哺乳動物細胞的表達外源蛋白的細胞模型，當帶有目的基因的載體通過實驗操作整合到細胞基因組中，能夠完成正確的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白加工過程，所表達的目的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能上與天然的基本相同[20]。同時，果蠅S2細胞是半懸浮細胞，具有易于培養(yǎng)、生長速率較快等優(yōu)勢。因此，本研究利用果蠅S2細胞為體外模型，通過改變SmD3的表達后檢測U2A的表達水平，探究兩者的相互作用，借助功能已知的U2A來闡述SmD3可能的新功能。通過研究發(fā)現(xiàn)，當SmD3基因表達水平下降時，U2A的表達水平補償性上調(diào)。有趣的是，當SmD3基因表達水平上調(diào)時，一定程度上抑制了U2A的表達。由此，筆者提出了一個工作模型，果蠅S2細胞中SmD3與U2A處于相互競爭的關(guān)系。因此，筆者提出猜想，SmD3作為被鑒定到的參與調(diào)控生殖干細胞自我更新及分化的因子之一，可能通過影響U2A發(fā)揮作用。本研究僅在體外實驗中通過S2細胞初步提出SmD3對U2A的影響，而SmD3對果蠅生殖干細胞的調(diào)控機制還需進行體內(nèi)實驗來進一步探索。本研究中通過干涉效率驗證篩選到SmD3 siRNA-1片段，可為后續(xù)研究中制備SmD3 RNAi果蠅提供靶向序列。此外，本研究成功構(gòu)建了pUAS-attB-SmD3克隆，可為后續(xù)研究中SmD3轉(zhuǎn)基因果蠅的制備提供過表達質(zhì)粒，以便進行果蠅體內(nèi)實驗進一步驗證及深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果證實果蠅S2細胞中SmD3與剪接因子U2A發(fā)揮相互拮抗的作用，從而可以為進一步研究剪接體核心蛋白SmD3的生物學功能提供思路。