前體物質(zhì)對紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的影響

趙赟鑫 張歡 周俞辛

摘要：根據(jù)紫杉醇的結(jié)構(gòu)特點和紅豆杉中紫杉醇的合成機制，選取了幾種前體物質(zhì)，研究其對紅豆杉內(nèi)生真菌合成紫杉醇的影響。結(jié)果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)的第10天，補加下列任一前體物質(zhì)，使發(fā)酵液中初始濃度分別達(dá)到苯甲酸鈉30.0 mg/L，酪氨酸20.0 mg/L，L-苯丙氨酸3.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，均能提高紫杉醇產(chǎn)量。進一步采用L16（45）正交試驗分析得到，4種前體物質(zhì)在培養(yǎng)基中的最佳組合為A3B3C3D1，即L-苯丙氨酸3.0 mg/L，酪氨酸40.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，苯甲酸鈉10.0 mg/L，對應(yīng)發(fā)酵液中紫杉醇含量達(dá)到987.3 μg/L。

關(guān)鍵詞：紅豆杉;紫杉醇;內(nèi)生真菌;前體物質(zhì);代謝調(diào)控;紫杉醇合成;生物量提高

中圖分類號： S182 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0234-05

近幾年來，關(guān)于紅豆杉產(chǎn)紫杉醇的研究進展得很快，國內(nèi)外利用紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究報道逐漸增多，目前紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的含量普遍偏低，國內(nèi)外學(xué)者正在不斷探索能夠提高紅豆杉內(nèi)生真菌紫杉醇產(chǎn)量的途徑[1]。

前體是指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化學(xué)物質(zhì)，它能被微生物利用并直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而產(chǎn)物自身結(jié)構(gòu)變化不大，有些還具有促進產(chǎn)物合成的作用。前體一般分為內(nèi)源性前體和外源性前體，如短鏈脂肪酸等內(nèi)源性前體由于是生物體自身代謝所合成的中間體，微生物對其都有較好的耐受性;而外源性前體由于微生物自身難以合成，其濃度較高時對產(chǎn)物合成和微生物的生長都有毒害作用[2]。

目前，對植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇的代謝調(diào)控研究較少，不過關(guān)于植物細(xì)胞生物合成紫杉醇的研究成果相對較多，對微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的研究具有很重要的借鑒價值。

紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自于甲瓦龍酸途徑，C13側(cè)鏈來自于苯丙氨酸，向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸可增加紫杉醇的生物合成量。Strobel等通過向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸、亮氨酸及乙酸鈉來研究前體物質(zhì)對紫杉醇生物合成的影響，結(jié)果表明，苯丙氨酸、亮氨酸及乙酸鈉均能促進紫杉醇的生物合成，其中乙酸鈉不但能夠摻入到乙?；校夷軌驌饺氲阶仙纪楣羌芗氨江h(huán)中，是紫杉醇合成的有效前體[3]。李家儒等在紅豆杉懸浮培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的L-苯丙氨酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、甘氨酸、α-旅烯、松節(jié)油，結(jié)果表明，各前體物對紅豆杉細(xì)胞生長均無明顯影響，卻都不同程度地促進了紫杉醇的合成[4]。但是，郭志剛等的研究卻得出了相反的結(jié)果，其研究發(fā)現(xiàn)，添加L-苯丙氨酸對紫杉醇的生物合成沒有顯著促進作用，苯甲酸鈉和乙酸鈉抑制紫杉醇的合成，他認(rèn)為，C13側(cè)鏈合成的前體含量并不是紫杉醇生物合成的限制性因素[5]。

本研究采用筆者所在課題組自行分離的紫杉醇高產(chǎn)菌株Metarhizium anisopliae LB-10[6]為試驗對象，在對其培養(yǎng)基組成和配比[7]、發(fā)酵條件[8]研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)紫杉醇的結(jié)構(gòu)特點和紅豆杉中紫杉醇的合成機制，選取幾種前體物質(zhì)，研究它們對紅豆杉內(nèi)生真菌合成紫杉醇的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅豆杉內(nèi)生真菌Metarhizium anisopliae LB-10是分離自陜西省留壩縣野生紅豆杉的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，水 1.0 L，pH值6.0～8.0;種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，水1.0 L，pH值6.0～8.0;發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50.0 g/L，NH4NO3 6.0 g/L，無水MgSO4 0.3 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，維生素B1 50.0 mg/L，pH值7.0。

1.1.3 藥品與試劑 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、乙酸乙酯、甲醇、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、苯甲酸鈉、L-苯丙氨酸、乙酸鈉、酪氨酸。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀（LC 2000）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV-10，IKA）、電子天平（TB-214）、雙層恒溫干燥培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102C）、人工氣候箱（LRH-250-G-S）、數(shù)控超聲波清洗儀（KQ-5200-DE）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法：在新鮮斜面上取 5 mm×5 mm大小的已純化菌塊，接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng) 3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液混勻，按5%的接種量接種到裝有330 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于27 ℃、180 r/min 搖床上培養(yǎng)10 d。每次提取所用發(fā)酵液的量為 1 000 mL。

1.2.2 紫杉醇樣品的提取 通過對培養(yǎng)10 d的發(fā)酵液進行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體2部分，菌絲體用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過分液漏斗萃取，分別重復(fù)3次，合并收集乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過濾，濾液在 40 ℃ 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，樣品用甲醇溶解并且定容至 10.0 mL，檢測。

1.2.3 紫杉醇的高效液相色譜檢測 將紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容至10.0 mL，配置成濃度為0.01～0.16 mg/mL的溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg，用甲醇定容至10.0 mL，從而得到濃度為0.40 mg/mL的母液，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL，取 20.0 μL 進樣（N=5，N表示參與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的濃度點和響應(yīng)值個數(shù)），得到的回歸方程為y=6.087 8+3 589.391 3x，r=0.999 222。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），采用外標(biāo)法測定內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯抽提物中的紫杉醇含量。

色譜條件：以水-甲醇-乙腈（體積比為33 ∶ 35 ∶ 32）為流動相，檢測波長為228 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為 20.0 μL，柱溫為室溫，色譜柱為C18（4.6 mm×150.0 mm）。

紫杉醇含量的計算公式：發(fā)酵液中紫杉醇的含量=[甲醇中紫杉醇的含量×溶解提取物所用甲醇的體積]÷提取時所取發(fā)酵液的體積。

每次提取的紫杉醇均作3個平行樣，分別經(jīng)高效液相色譜（HPLC）測定并通過公式計算發(fā)酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4 生物量的測定 取一定體積的發(fā)酵液在4 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，計算菌絲體生物量。

1.2.5 添加前體物質(zhì)的研究方法

1.2.5.1 單因素試驗 以L-苯丙氨酸作為前體物質(zhì)：采用蒸餾水作為助溶劑，采用“1.1.2”節(jié)中的發(fā)酵培養(yǎng)基和“1.2.1”節(jié)中的培養(yǎng)方法，在LB-10對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加L-苯丙氨酸水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達(dá)到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，以不添加L-苯丙氨酸水溶液作為空白對照，研究L-苯丙氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

以苯甲酸鈉作為前體物質(zhì)：采用蒸餾水作為助溶劑，在LB-10對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加苯甲酸鈉水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達(dá)到10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L，以不添加苯甲酸鈉水溶液作為空白對照，研究苯甲酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

以乙酸鈉作為前體物質(zhì)：采用蒸餾水作為助溶劑，在 LB-10 對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加乙酸鈉水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達(dá)到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L，以不添加乙酸鈉水溶液作為空白對照，研究乙酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

以酪氨酸作為前體物質(zhì)：采用甲酸作為助溶劑，在LB-10對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加酪氨酸甲酸溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達(dá)到5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L，以不添加酪氨酸甲酸溶液作為空白對照，研究酪氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

1.2.5.2 正交試驗及驗證性試驗 選取對紫杉醇積累和菌體生長有較大影響的苯甲酸鈉、酪氨酸、L-苯丙氨酸和乙酸鈉的初始濃度，各取4個水平，均在發(fā)酵第10天加入發(fā)酵液中，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進行L16（45）正交試驗及驗證性試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-苯丙氨酸對LB-10紫杉醇產(chǎn)量和生物量的影響

苯丙氨酸是α-氨基酸的一種，具有生物活性的光學(xué)異構(gòu)體為L-苯丙氨酸，為白色晶體或結(jié)晶性固體，溶于水，難溶于甲醇、乙醇和乙醚[9]。

由圖2可知，在0～3.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，LB-10的紫杉醇產(chǎn)量隨L-苯丙氨酸濃度的增加而增大，當(dāng)L-苯丙氨酸的濃度為3.0 mg/L時，發(fā)酵液紫杉醇含量達(dá)到最大值，其平均含量為972.1 μg/L，當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為4.0 mg/L及以上時，紫杉醇的產(chǎn)量急劇下降，但是菌絲體生物量一直呈上升趨勢。表明L-苯丙氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。高濃度的L-苯丙氨酸對菌絲體生長有利，由于紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自甲瓦龍酸途徑，C13側(cè)鏈來自于苯丙氨酸[10]，向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸可增加紫杉醇的合成量，因此，添加適量的L-苯丙氨酸可以較好地促進紫杉醇的生物合成。

2.2 苯甲酸鈉對LB-10紫杉醇產(chǎn)量和生物量的影響

苯甲?；羌t豆杉紫杉醇合成過程中的酰化步驟之一，由于在C2位置上有苯甲?；@一基團[11]，因此苯甲酸可能是微生物合成紫杉醇的前體。由于苯甲酸在常溫下很難溶于水，直接使用苯甲酸進行研究比較困難，通常使用的是其鈉鹽，例如苯甲酸鈉，但苯甲酸仍然起主要作用。苯甲酸鈉，別稱安息香酸鈉，為白色顆?；蚪Y(jié)晶性粉末，在空氣中穩(wěn)定，易溶于水，且親油性較大[9]。

由圖3可知，在0～30.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，苯甲酸鈉對紫杉醇合成有明顯的促進作用，在添加量為30.0 mg/L時，發(fā)酵液中紫杉醇含量達(dá)到了983.2 μg/L，繼續(xù)增加濃度至 40.0 mg/L 時，紫杉醇產(chǎn)量開始下降，且苯甲酸鈉對菌絲體生長有明顯抑制作用。表明苯甲酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。高濃度的苯甲酸鈉對菌絲體生長不利，且添加適量的苯甲酸鈉可以較好地促進紫杉醇的生物合成。由于苯甲酸鈉的親油性較大，易穿透細(xì)胞膜進入細(xì)胞體內(nèi)，干擾細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致菌絲體加速老化。

2.3 乙酸鈉對LB-10紫杉醇產(chǎn)量和生物量的影響

乙酸鈉，俗名醋酸鈉，為無色無味的結(jié)晶體，在空氣中可被風(fēng)化，可燃，溶于水和乙醚，微溶于乙醇[9]。由圖4可知，在0～3.0 g/L濃度范圍內(nèi)，乙酸鈉對紫杉醇合成有明顯的促進作用，在添加量為3.0 g/L時，發(fā)酵液中紫杉醇平均含量達(dá)到了964.8 μg/L。繼續(xù)將濃度增加至4.0 g/L時，紫杉醇產(chǎn)量開始下降，且乙酸鈉在試驗范圍內(nèi)對菌體生長有抑制作用。表明乙酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。高濃度的乙酸鈉對菌絲體生長不利，而添加適量的乙酸鈉可以較好地促進紫杉醇的生物合成。由于乙酸鈉不僅能摻入到苯環(huán)及紫杉烷骨架中，而且能摻入到乙?；?，因此是紫杉醇合成的有效前體。

2.4 酪氨酸對LB-10紫杉醇產(chǎn)量和生物量的影響

酪氨酸是一種白色結(jié)晶體或結(jié)晶粉末，易溶于甲酸，難溶于水，不溶于乙醇和乙醚[9]。由圖5可以看出，在0～20.0 mg/L 濃度范圍內(nèi)，酪氨酸對紫杉醇合成和菌絲體生長均有明顯的促進作用，在添加量為20.0 mg/L時，發(fā)酵液中紫杉醇含量達(dá)到了980.9 μg/L，隨后繼續(xù)增大添加濃度，會抑制菌體生長和紫杉醇生物合成。表明酪氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。由于L-苯丙氨酸在生物體內(nèi)可被輔酶四氫生物蝶呤可逆地轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，而紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自甲瓦龍酸途徑，C13側(cè)鏈來自于苯丙氨酸[10]，因此酪氨酸是能夠間接提高紫杉醇產(chǎn)量的前體物質(zhì)。

2.5 前體交互作用

“2.1～2.4”節(jié)中分析了4種前體物質(zhì)及其濃度對發(fā)酵的單因素影響，由于各個試驗批次之間往往存在較大差別，因此需要對各因素進行綜合考察，才能確定較優(yōu)的前體組合。

本研究選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有一定影響的 L-苯丙氨酸、酪氨酸、苯甲酸鈉和乙酸鈉為前體物質(zhì)，各取4個水平，均在發(fā)酵第10天加入發(fā)酵液中，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進行L16（45）正交試驗，試驗設(shè)計見表1。

從表2可以看出，根據(jù)極差R值的大小得到，各因素對試驗結(jié)果影響次序為A>B>D>C，即L-苯丙氨酸對LB-10紫杉醇產(chǎn)量影響最大，其次是酪氨酸，再次是苯甲酸鈉，最后是乙酸鈉。

2.6 驗證性試驗

采用優(yōu)化后發(fā)酵液培養(yǎng)，在LB-10發(fā)酵培養(yǎng)的第10天，同時添加L-苯丙氨酸3.0 mg/L，酪氨酸40.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，苯甲酸鈉10.0 mg/L，繼續(xù)再培養(yǎng)4 d。以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，對LB-10菌株進行搖瓶發(fā)酵驗證試驗，分別提取5次紫杉醇樣品進行HPLC檢測。結(jié)果（表4）表明，LB-10紫杉醇產(chǎn)量的RSD為0.17%，說明測定方法重現(xiàn)性良好，發(fā)酵液中紫杉醇含量平均值達(dá)到 987.3 μg/L。

3 討論與結(jié)論

所謂代謝調(diào)控，就是通過定向改良細(xì)胞的代謝特性，對特定的生化反應(yīng)進行修飾，從而實現(xiàn)合成新產(chǎn)物或提高目的產(chǎn)物產(chǎn)率以及減少副產(chǎn)物產(chǎn)率的目的。在正常的生理條件下，微生物總是通過協(xié)調(diào)系統(tǒng)最經(jīng)濟地吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)，用于合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進行生長和繁殖，一般不積累中間代謝產(chǎn)物。代謝人工調(diào)控是指打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進行。因此，在了解紫杉醇生物合成途徑和催化各步反應(yīng)酶的特性后，有目的地控制培養(yǎng)條件，通過添加重要前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子及抑制劑，對關(guān)鍵酶活性進行調(diào)節(jié)，抑制其他無用的旁路途徑，是完全可以提高紫杉醇產(chǎn)量的。

本研究根據(jù)紅豆杉紫杉醇的合成機制和紫杉醇的結(jié)構(gòu)特點，選取L-苯丙氨酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、酪氨酸分別作為前體物質(zhì)，研究其對Metarhizium anisopliae LB-10合成紫杉醇的影響。結(jié)果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)的第10天，補加任一生長調(diào)節(jié)劑，使發(fā)酵液中初始濃度分別為苯甲酸鈉30.0 mg/L，酪氨酸20.0 mg/L，L-苯丙氨酸3.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，均能提高紫杉醇產(chǎn)量。

進一步采用L16（45）正交試驗分析得到，4種前體物質(zhì)在培養(yǎng)基中的最佳組合為A3B3C3D1，即L-苯丙氨酸 3.0 mg/L，酪氨酸40.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，苯甲酸鈉 10.0 mg/L，對應(yīng)發(fā)酵液中紫杉醇含量達(dá)到987.3 μg/L。

本研究的幾種前體物質(zhì)基本上都在濃度增加到一定程度后，產(chǎn)生了對紫杉醇合成的不利影響，原因在于對大部分前體而言，都能促進終產(chǎn)物的生成，但許多外源前體的加入又會抑制植物細(xì)胞或菌絲體的生長，從而最終影響了次生代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)量，而添加外源前體的目的是要促進代謝終產(chǎn)物的生成，因此，要篩選前體的最佳添加濃度，不同的前體其最佳添加濃度是不同的，且前體濃度不同，對次生代謝物合成的影響也不同。

紫杉醇具有細(xì)胞毒害作用[12]，通常不會大量地合成，只有在特殊環(huán)境脅迫條件下，初生代謝受到抑制，次生代謝產(chǎn)物才會大量合成。在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，添加某些前體物質(zhì)，在紫杉醇產(chǎn)量較高時，生物量卻較低。這就造成紫杉醇生物合成和菌絲體生長之間的矛盾，因此找到二者最佳平衡點是目前需要解決的問題，也是實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的必要條件。

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