2015—2017年河南省豬德爾塔冠狀病毒S基因和N基因遺傳變異分析

董建國 饒丹 李迎曉

摘要：為了解河南地區(qū)豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）的遺傳變異情況，采用RT-PCR方法對2015—2017年采自河南省南部地區(qū)豬場疑似PDCoV豬腸道內(nèi)容物中的S和N基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，本次擴(kuò)增基因間同源性較高，單獨(dú)成一支，且與我國分離的CH/Sichuan/S27/2012毒株、泰國分離的Swine/Thailand/S5011、美國近些年分離的毒株位于同一分支。近年我國大陸分離的其他毒株和我國香港早期分離的HKU15-44、HKU15-155均位于另一分支，故結(jié)果提示河南地區(qū)PDCoV發(fā)生了一定的變異，該研究結(jié)果為本地區(qū)PDCoV疫情的防控提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬德爾塔冠狀病毒;S基因;N基因;變異分析

中圖分類號： S852.65+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0052-03

冠狀病毒能感染多種動(dòng)物甚至人類，引起呼吸道和腸道疾病。冠狀病毒一般可分為α冠狀病毒、β冠狀病毒和γ冠狀病毒3個(gè)群，最近國際病毒分類委員會(huì)在原有基礎(chǔ)上增加了δ冠狀病毒群。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為α冠狀病毒，均能引起豬腹瀉、嘔吐甚至死亡。2009年，在豬腸道腹瀉樣品中，研究人員檢測出豬冠狀病毒，經(jīng)鑒定為豬δ冠狀病毒（PDCov），屬于δ冠狀病毒群[1]。目前，由冠狀病毒引起的豬腸道疾病對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。2009年，我國香港首次報(bào)道在豬腹瀉病料中檢測到2個(gè)豬δ冠狀病毒，命名為HKU 15-44和HKU 15-155[1]。2014年2月，美國俄亥俄州農(nóng)業(yè)部宣布美國存在豬δ冠狀病毒。1個(gè)月后明尼蘇達(dá)大學(xué)首次全基因測序一株豬δ冠狀病毒SDVC/USA/Illinois121/2014[2]。此后不久，愛荷華州立大學(xué)做出了同樣的報(bào)道[3]。至2015年1月，美國至少20個(gè)州暴發(fā)豬δ冠狀病毒[4]。2014年4月，韓國出現(xiàn)豬δ冠狀病毒[5]。2015年，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)首次報(bào)道我國大陸出現(xiàn)豬δ冠狀病毒[6]。

近年來，豬腹瀉相關(guān)傳染病對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。針對此次豬δ冠狀病毒的爆發(fā)，河南地區(qū)還未有相關(guān)分子流行病學(xué)調(diào)查。因此，本研究以豬δ冠狀病毒為研究對象，針對纖突蛋白（S）基因和核蛋白（N）基因進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，以掌握我國豬δ冠狀病毒的流行現(xiàn)狀，為豬δ冠狀病毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

針對2015—2017年河南省駐馬店和信陽地區(qū)豬場疑似暴發(fā)豬德爾塔冠狀病毒的自然發(fā)病豬，采集發(fā)病豬腸道組織及腹瀉樣品于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，所有試?yàn)均在信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院動(dòng)物疾病檢測實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自Magen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于Promega公司產(chǎn)品;RT-PCR相關(guān)試劑盒，購自ToYoBo生物科技有限公司和Vazyme公司;DNA Marker DL 2000等，購自TaKaRa公司;EB替代染料，購自廣州華奇盛生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的CH SXD12015等豬德爾塔冠狀病毒毒株全基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)S基因、M基因和N基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增其全長的特異性引物序列。引物由江蘇蘇州金維智生物公司合成。引物信息見表1。

1.4 S和N基因的擴(kuò)增及克隆

將小腸內(nèi)容物加入1 mL滅菌PBS混勻，按TRIzol試劑盒操作說明書提取病料組織總RNA。以提取的總RNA為模板，采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。然后以cDNA為模板，S1F/R、S2F/R、S3F/R、MF/R和NF/R為引物，使用TOYOBO生物科技有限公司高保真酶對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgSO4 3 μL，cDNA模板4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，RNase Free H2O 28 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s/kb，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR陽性樣品用凝膠回收后克隆于pEASY-Simple T1 Cloning Vector載體上，陽性重組質(zhì)粒由江蘇蘇州金維智生物公司測序。

1.5 序列比對與分析

利用Lasergene及Mega 5.0軟件對不同病毒株的S基因和N基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，PDCov代表毒株的基因序列均下載自GenBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測

采用S和N基因特異性引物擴(kuò)增出S的3個(gè)片段S1、S2、S3和N基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析表明，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致，測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段是PDCov，編號分別為ZMD1、ZMD2、ZMD3、XY1、XY2，ZMD代表駐馬店地區(qū)，XY代表信陽地區(qū)（圖1、圖2、圖3、圖4）。

2.2 PDCoV S基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

運(yùn)用分子生物學(xué)軟件Mega 5.0對測定的S基因序列和國內(nèi)外具有代表性的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）顯示，整個(gè)遺傳進(jìn)化樹可分為兩大分支， 其中擴(kuò)增的PDCoV S基因與我

國大陸毒株CH/Sichuan/S27/2012、我國臺灣毒株Swine/Thailand/S5011和美國毒株P(guān)DCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014處于同一分支Group Ⅰ，且擴(kuò)增的S基因單獨(dú)形成一支。2015年我國分離的PDCoV毒株以及2004年分離的CHN/AH/2004、2014年分離的CHN/HB/2014和2009年我國香港分離的HKU15-44、HKU15-155處于同一分支Group Ⅱ。

2.3 PDCoV N基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

運(yùn)用分子生物學(xué)軟件Mega 5.0對測定的N基因序列和國內(nèi)外具有代表性的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖6）顯示，整個(gè)遺傳進(jìn)化樹可分為兩大分支，其中擴(kuò)增的PDCoV N基因與我國大陸毒株CH Sichuan/S27/2012、我國臺灣毒株Swine/Thailand/S5011和美國毒株P(guān)DCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014處于同一分支Group Ⅰ，且擴(kuò)增的N基因單獨(dú)形成一支。2015年中國分離的PDCoV毒株以及2004年分離的CHN/AH/2004、2014年分離的CHN/HB/2014和2009年香港分離的HKU15-44、HKU15-155處于同一分支Group Ⅱ。

3 討論

冠狀病毒能夠引起人、哺乳動(dòng)物和禽類發(fā)病，對公共安全具有潛在威脅。δ冠狀病毒是冠狀病毒家族的新成員，于2009年首次在香港的野禽中被發(fā)現(xiàn)[7]。2014年2月美國在俄亥俄州發(fā)現(xiàn)首例PDCoV，隨后在20多州的豬群中發(fā)現(xiàn)PDCoV[4]。近幾年，我國多省份均有PDCoV的報(bào)道[8]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室從2015年9月起對來自河南省不同地區(qū)的腹瀉病料樣品進(jìn)行PDCoV檢測，共檢測出5份陽性。

PDCoV基因組全長約25 kb，依次編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）[2-3]。PDCoV具有冠狀病毒的一般特性，S蛋白在病毒和宿主結(jié)合和產(chǎn)生中和抗體等方面起著重要的作用，是冠狀病毒主要的抗原蛋白和新型疫苗研究的首選蛋白[8]。N蛋白是冠狀病毒的核衣殼蛋白，在細(xì)胞因子產(chǎn)生方面發(fā)揮作用。根據(jù)S蛋白和N蛋白的進(jìn)化樹分析可知，本次擴(kuò)增的基因之間同源性較高，單獨(dú)成一支，且與我國大陸分離的CH/Sichuan/S27/2012毒株和我國臺灣、美國近些年分離的毒株位于同一分支。與近些年中國分離的其他毒株不在一個(gè)分支，這些結(jié)果表明河南地區(qū)PDCoV發(fā)生了一定的變異。

PDCoV與另外2個(gè)豬冠狀病毒PEDV[9]和TGEV一樣，均能引起豬腸道疾病。研究表明，PDCoV感染仔豬后，能夠引起仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和明顯的腸道病變，致死率高達(dá)40%[10]。與PEDV不同的是，PDCoV不僅感染腸道，還能夠感染肺臟、腎臟和肝臟等多個(gè)器官，并引起相應(yīng)器官不同程度的病變，說明豬PDCoV比PEDV有更高的組織嗜性，并且，PDCoV和PEDV之間沒有交叉免疫反應(yīng)。因此，研制有效的疫苗用于該病的防控是急需解決的問題。目前還沒有針對PDCoV的商品化疫苗與診斷試劑。隨著研究的深入，相信不久的將來，會(huì)有效果很好的PDCoV疫苗和診斷試劑用于控制該病的發(fā)生與流行。

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