透骨消痛膠囊抑制大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的實驗研究

許麗梅 邵翔 曾建偉 賈良良 何曉娟 李慧 葉蕻芝 李西海

【摘 要】目的：探討透骨消痛膠囊抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機制。方法：將30只2月齡SPF級SD雄性大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組（10只）和模型組（20只）。模型組采用改良Hulth法建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，按照隨機數(shù)字表法分為模型對照組和透骨消痛膠囊組，每組10只。透骨消痛膠囊組用透骨消痛膠囊溶液（10 mL·kg-1·d-1）灌胃，空白對照組、模型對照組連續(xù)等劑量生理鹽水灌胃，持續(xù)12周。觀察大鼠股骨髁軟骨的整體形態(tài)學變化情況，另使用HE染色和甲苯胺藍染色觀察大鼠軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)及軟骨蛋白多糖的表達，并用ELISA法檢測滑膜組織中炎癥相關(guān)因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β），以及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）水平。結(jié)果：HE染色結(jié)果表明，空白對照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，軟骨細胞排列規(guī)則，層次清晰;模型對照組軟骨表面粗糙，軟骨細胞排列紊亂，軟骨細胞異常分化;透骨消痛膠囊組關(guān)節(jié)軟骨表面比模型對照組完整，層次較為清晰，軟骨細胞形態(tài)較好。甲苯胺藍染色顯示，空白對照組軟骨染色呈紫紅色，染色較深且均勻;模型對照組軟骨染色明顯變淺;透骨消痛膠囊組軟骨染色較模型對照組深，染色相對均勻。ELISA法檢測結(jié)果顯示，模型對照組滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平均高于空白對照組（P < 0.05），透骨消痛膠囊組低于模型對照組（P < 0.05），透骨消痛膠囊組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結(jié)論：透骨消痛膠囊能有效抑制炎癥反應所引起的關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，延緩骨關(guān)節(jié)炎病理進程。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;透骨消痛膠囊;軟骨退變;大鼠

inhibiting cartilage degeneration in osteoarthritis.Methods：Thirty two-month-old SPF SD male rats were randomly divided into a blank control group（10 rats）and a model group（20 rats）.The model group was divided into a model control group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group randomly after the models were established according to modified Hulth method，with 10 rats in each group.For 12 weeks，the rats in the Tougu Xiaotong Jiaonang group were given Tougu Xiaotong Jiaonang solution（10 mL·kg-1·d-1）by gavage，while the blank control group and the model control group were given orally the same dose of saline by gavage.The morphological changes of their femoral condylar cartilage were observed.The morphological structure of rat cartilage and the expression of cartilage proteoglycan were observed by HE staining and toluidine blue staining.Inflammation-related factors such as TNF-α，IL-1β and MMP-13 in synovial tissue were detected by ELISA.Results：HE staining showed that the surface of articular cartilage in the blank control group was smooth，the arrangement of chondrocyte was regular and the layers were clear.The surface of cartilage in the model control group was rough，the arrangement of chondrocyte was disordered，and the chondrocyte was abnormally differentiated.The surface of articular cartilage in the Tougu Xiaotong Jiaonang group was complete，the layers were clear and the shape of chondrocyte was good，all better than those in the control group.Toluidine blue staining showed that the cartilage staining in the blank control group was purple red，deep and even.The cartilage staining in the model control group was significantly lighter.The cartilage staining in the Tougu Xiaotong Jiaonang group was deeper and more uniform than that in the model control group.ELISA results showed that the level of TNF-α，IL-1β and MMP-13 in synovial tissue of the model control group were higher than those of the blank control group（P < 0.05），and the level of them in the Tougu Xiaotong Jiaonang group were lower than those of the model control group（P < 0.05）.There was no significant difference between the Tougu Xiaotong Jiaonang group and the blank control group（P > 0.05）.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang can effectively inhibit the degenerative lesions of articular cartilage caused by inflammatory reaction and delay the pathological process of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）;cartilage degeneration;rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是由于膝關(guān)節(jié)局部生物學和力學的改變，引起軟骨細胞、軟骨細胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者合成-降解偶聯(lián)機制失衡的一種慢性、進行性骨關(guān)節(jié)疾病[1]。隨著人口老齡化不斷增加，OA發(fā)病率隨之增長[2]。目前，OA尚無特效療法，主要以緩解癥狀、提高生活質(zhì)量為主[3]。透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎、腫節(jié)風4味中藥組成，具有補肝腎、強筋骨、止痹痛之功，是臨床治療OA的常用方。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，透骨消痛膠囊能有效改善OA的臨床癥狀，降低炎癥因子水平，減少含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶4（ADAMTS4）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）分泌[4-5]。因此，本研究擬進一步分析透骨消痛膠囊干預OA動物模型的作用及相關(guān)炎癥因子水平變化。以改良Hulth法復制OA動物模型作為研究對象，采用病證結(jié)合的方法，從以方測證的角度探討透骨消痛膠囊抑制OA軟骨退變的作用機制，以期為臨床運用透骨消痛膠囊提供相關(guān)理論支持。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠30只，2月齡，體質(zhì)量（200±20）g，來源于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號SCXK（滬）2012-0002。動物實驗方案通過醫(yī)學動物實驗倫理委員會審批。

1.2 實驗藥物 透骨消痛膠囊為福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，閩制字Z20100006，藥物組成：巴戟天12 g、白芍12 g、川芎6 g、腫節(jié)風6 g。按照上述藥物劑量稱取藥材，加入14倍藥量體積的蒸餾水，經(jīng)高溫加熱2 h回流提取藥液，共重復提取2次，合并2次藥液后過濾，濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑與儀器 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、MMP-13 ELISA試劑盒（美國R&D公司）;質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛（中國天津福晨化學試劑廠）;質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛（鄭州德眾化學試劑廠）;甲苯胺藍（國藥集團化學試劑有限公司）;HE染色試劑盒（中國北京索萊寶公司）。光學顯微鏡（德國Leica公司）;ELX-800酶標儀（美國Bio-tek公司）。

2 方 法

2.1 實驗動物模型建立與分組 將30只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組（10只）和模型組

（20只）。模型組采用改良Hulth法（切斷內(nèi)側(cè)副韌帶與前交叉韌帶、摘除內(nèi)側(cè)半月板），建立雙側(cè)大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型[6]，按照隨機數(shù)字表法分為模型對照組和透骨消痛膠囊組，每組10只。

2.2 藥物干預 大鼠給藥劑量按人和動物藥物等效劑量換算[7]，計算后根據(jù)實驗需要，將透骨消痛膠囊溶液濃縮至含生藥量0.308 g·mL-1。

透骨消痛膠囊組給予透骨消痛膠囊溶液

10 mL·kg-1·d-1灌胃，空白對照組、模型對照組以生理鹽水10 mL·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)12周。

2.3 實驗動物取材與形態(tài)觀察 質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨髁。股骨髁采用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色和甲苯胺藍染色后，顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學變化。

2.4 ELISA法檢測滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平 精密稱取20 mg滑膜組織，加入磷酸鹽緩沖劑，冰上超聲粉碎，4 ℃，離心機以12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行操作測得OD值，建立標準曲線代入OD值計算出各樣品TNF-α、IL-1β、MMP-13數(shù)值。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。ELISA法檢測滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平的組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 關(guān)節(jié)軟骨整體形態(tài)觀察 空白對照組各股骨髁軟骨表面光滑完整，富有光澤、彈性，關(guān)節(jié)邊緣平整，無缺損、裂紋和骨贅，見圖1（1）。模型對照組軟骨表面異常粗糙，無光澤，可見局部表面軟骨缺損，軟骨下骨裸露，軟骨邊緣失去完整性并伴骨贅生成，見圖1（2）。透骨消痛膠囊組軟骨面基本完整，略粗糙，關(guān)節(jié)邊緣有輕微骨贅，未見軟骨下骨裸露，見圖1（3）。

3.2 HE染色觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài) 空白對照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，各層結(jié)構(gòu)清晰，界限清楚，軟骨細胞排列規(guī)則、分布均勻，細胞核染色呈藍色，軟骨基質(zhì)著色均勻，呈淺粉紅色，見圖2（1）。

模型對照組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平，各結(jié)構(gòu)層次紊亂，軟骨細胞排列欠佳，可見肥大分化軟骨細胞，軟骨下骨有髓腔形成，見圖2（2）。透骨消痛膠囊組關(guān)節(jié)軟骨表面較為平滑完整，且有著清晰的層次，軟骨細胞排列和分層較為規(guī)律完整，

見圖2（3）。

3.3 甲苯胺藍染色觀察關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖變化 空白對照組軟骨染色為紫紅色，軟骨表面完整，軟骨上部分染色深而均勻，軟骨細胞排列整齊，見圖3（1）;模型對照組軟骨染色呈淺藍色，軟骨細胞排列失去規(guī)則，并可見肥大軟骨細胞，見圖3（2）;透骨消痛膠囊組軟骨染色呈藍紫色，染色相對均勻，軟骨細胞未見明顯肥大現(xiàn)象，見圖3（3）。

3.4 ELISA法檢測滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平比較 ELISA檢測結(jié)果顯示，模型對照組滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平高于空白對照組（P < 0.05），透骨消痛膠囊組滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平低于模型對照組（P < 0.05）;透骨消痛膠囊組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

4 討 論

OA屬中醫(yī)學“痹證”“痿證”范疇，因風、寒、濕邪等侵犯機體，邪阻經(jīng)絡(luò)，氣血運行不暢而發(fā)病，早期以關(guān)節(jié)疼痛、麻木、屈伸不利等為主要表現(xiàn)。基于OA本痿標痹的核心病機[8]，臨床治療多采用補腎柔肝，活血祛風，標本兼治之法[9-10]。透骨消痛膠囊以巴戟天為君藥，溫陽補腎以治本;白芍為臣藥，養(yǎng)血柔肝;川芎為佐藥，活血行血;腫節(jié)風為使藥，祛風除濕。四藥合用，共奏補肝腎、強筋骨、止痹痛之功，標本兼治。

從關(guān)節(jié)的整體形態(tài)觀察、HE染色及甲苯胺藍染色可以看出，模型對照組大鼠膝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)典型的OA病變特征，主要有關(guān)節(jié)表面粗糙不平、軟骨層變薄，四層結(jié)構(gòu)不清晰，同時伴有軟骨細胞肥大，排列紊亂，甚者有骨贅形成。說明改良Hulth法能夠成功復制大鼠OA動物模型。透骨消痛膠囊干預OA模型大鼠后，大鼠關(guān)節(jié)軟骨病變程度明顯輕于模型對照組，鏡下觀察可見關(guān)節(jié)軟骨細胞無明顯肥大分化，著色尚均勻，軟骨表面相對完整且無明顯骨贅形成。說明透骨消痛膠囊可以促進蛋白多糖和軟骨基質(zhì)的合成分泌，有效減緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。

目前認為，OA的主要病理特征為軟骨細胞凋亡及軟骨基質(zhì)進行性降解導致關(guān)節(jié)軟骨的變性破壞、滑膜慢性炎癥、骨贅形成等[11]。隨著對OA發(fā)病機制研究的逐漸延伸，滑膜在OA病理進程中的作用不斷地被挖掘出來?；ぷ鳛殛P(guān)節(jié)的重要組成部分，能夠分泌關(guān)節(jié)液，營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨、潤滑關(guān)節(jié)面以減少摩擦，并能排泄廢物，對關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)代謝及關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定十分重要[12]。當滑膜受到刺激時會產(chǎn)生一系列的炎癥反應，導致大量細胞因子、趨化因子、活性氧和MMPs等分泌到滑液中[13]。其中MMPs是導致關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要酶類，MMP-13作為其中一員，其過度表達會導致膠原及蛋白多糖過度降解[14]。而TNF-α、IL-1β是導致關(guān)節(jié)炎癥損傷的重要炎性因子，在破壞軟骨細胞及軟骨基質(zhì)的同時[15]，還會促進MMPs的表達，從而加重軟骨基質(zhì)的降解。同時，兩者還可協(xié)同刺激滑膜細胞，加重關(guān)節(jié)滑膜炎癥。由此可見，滑膜炎會使關(guān)節(jié)腔內(nèi)相關(guān)炎癥因子表達增加，從而進一步加重軟骨退變。本研究結(jié)果顯示，模型對照組滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平顯著升高，表明OA與滑膜炎癥相關(guān)。而透骨消痛膠囊干預OA大鼠后，明顯抑制了滑膜組織中TNF-α、IL-1β、MMP-13的表達，說明抑制滑膜炎癥能夠成為有效治療OA的靶點之一。

綜合以上實驗結(jié)果，透骨消痛膠囊可以下調(diào)TNF-α、IL-1β、MMP-13的水平，抑制OA炎癥反應，改善炎癥對關(guān)節(jié)軟骨的破環(huán)，延緩軟骨基質(zhì)降解，達到抑制關(guān)節(jié)軟骨退變的功效。但本實驗尚缺乏相關(guān)作用機制及作用靶點的研究，在今后的研究中會增加多組設(shè)計，繼續(xù)開展多層次、多角度、多學科的研究，以進一步加深對透骨消痛膠囊作用機制的認識。

5 參考文獻

[1] CORR EM，CUNNINGHAM CC，HELBERT L，et al.Osteoarthritis-associated basic calcium phosphate crystals

activate membrane proximal kinases in human innate immune cells[J].Arthritis Res Ther，2017，19（1）：23.

[2] 中華醫(yī)學會骨科學分會關(guān)節(jié)外科學組.骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2018版）[J].中華骨科雜志，2018，38（12）：705-715.

[3] SUN MM，BEIER F，PEST MA.Recent developments in emerging therapeutic targets of osteoarthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2017，29（1）：96-102.

[4] 陳鴻，洪昆達.透骨消痛膠囊治療疼痛性膝骨性關(guān)節(jié)炎30例[J].福建中醫(yī)藥，2015，46（2）：21-22.

[5] 邵翔，陳后煌，陳達，等.透骨消痛膠囊抑制脂多糖誘導軟骨細胞炎癥反應的機制研究[J].國際骨科學雜志，2016，37（6）：406-410.

[6] 劉獻祥，李西海，周江濤.改良Hulth造模法復制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（12）：1104-1108.

[7] 黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學與治療學，2004，9（9）：1069-1072.

[8] 李照輝，梁珪清，劉伯齡，等.骨關(guān)節(jié)炎“本痿標痹”內(nèi)涵探討[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2015，4（7）：37-39.

[9] 李西海，陳文列，劉獻祥.補腎柔肝法防治骨性關(guān)節(jié)炎作用機制探討[J].福建中醫(yī)藥大學學報，2011，21（2）：66-69.

[10] 李西海，陳后煌，葉蕻芝，等.補腎柔肝法治療骨關(guān)節(jié)炎筋骨失養(yǎng)的作用探討[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（6）：40-42，46.

[11] BARR AJ，CAMPBELL TM，HOPKINSON D，et al.A systematic review of the relationship between subchondral bone features，pain and structural pathology in peripheral joint osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2015，17（1）：228.

[12] ASIF AMIN M，F(xiàn)OX DA，RUTH JH.Synovial cellular and molecular markers in rheumatoid arthritis[J].Semin Immunopathol，2017，39（4）：385-393..

[13] MALEMUD CJ.Matrix Metalloproteinases and Synovial Joint Pathology[J].Prog Mol Biol Transl Sci，2017，148（1）：305-325.

[14] AMAR S，SMITH L，F(xiàn)IELDS GB.Matrix metalloproteinase collagenolysis in health and disease[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2017，1864（11 Pt A）：1940-1951.

[15] CHARLIER E，RELIC B，DEROYER C，et al.Insights on Molecular Mechanisms of Chondrocytes Death in Osteoarthritis[J].Int J Mol Sci，2016，17（12）：E2146.

收稿日期：2019-04-20;修回日期：2019-05-26