針刺單穴與腧穴配伍對(duì)炎性痛大鼠痛閾及血清炎性因子的影響

何玲玲，林 棟，游世晶，陳采益

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122）

課題組前期研究表明針刺大鼠外關(guān)穴能特異性地促進(jìn)磷酸化環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）的表達(dá)，不論在小腦或皮質(zhì)扣帶回，針刺穴位組的p-CREB的較非穴組表達(dá)均明顯增強(qiáng)［1］。同時(shí)，針刺干預(yù)外關(guān)單穴可上調(diào)炎性痛大鼠皮質(zhì)扣帶回、海馬腦區(qū)Bcl-2表達(dá)［2］。因此，本項(xiàng)目組在基于經(jīng)穴及循經(jīng)取穴（單穴）特異性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀(guān)察針刺外關(guān)單穴與其腧穴配伍對(duì)炎性痛大鼠痛閾及血清炎性因子 P物質(zhì)（substance P，SP）、前列腺素 E2（PGE2）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）含量的影響，進(jìn)而探討單穴與腧穴配伍鎮(zhèn)痛效應(yīng)及相關(guān)神經(jīng)-體液-免疫機(jī)制，為經(jīng)穴配伍應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（300±50）g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0005。 自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h～12 h晝夜節(jié)律變換，室溫控制在18～24℃，濕度控制在50%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠前列腺素SP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠前列腺素E2酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素-1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ZH-LUO／B鼠尾測(cè)痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；一次性無(wú)菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)）；TGL-168高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）；數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組、外關(guān)組、外關(guān)配伍合谷組和外關(guān)配伍合谷、后溪組，每組各10只。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理符合國(guó)際疼痛研究會(huì)制定的準(zhǔn)則。

2.2 模型制作 實(shí)驗(yàn)人員用黑布罩住大鼠頭部，采用微量進(jìn)樣器于大鼠右前肢外側(cè)肘節(jié)穴（定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》三版教材中的大鼠的穴位圖譜：肘突與臂骨外上髁間的凹陷中，相當(dāng)于人體手少陽(yáng)經(jīng)天井穴）快速進(jìn)針，并循經(jīng)朝上注入1～2 mm相當(dāng)于“清冷淵”穴區(qū)注射5%甲醛50 μL，觀(guān)察動(dòng)物形態(tài)學(xué)和行為學(xué)變化，動(dòng)物注射后出現(xiàn)患肢紅腫、抖動(dòng)、縮肢等，示造模成功。采用鼠尾測(cè)痛儀測(cè)出疼痛閾值并記錄。

2.3 穴位選擇 外關(guān)穴取穴參照大鼠的穴位圖譜：位于腕關(guān)節(jié)上3 mm（近心端），尺、橈骨間，在指總伸肌與指?jìng)?cè)伸肌之間取穴；合谷穴：于前肢第一、第二掌骨之間；后溪穴：于第五掌骨小頭后方掌橫紋頭。針具選用華佗牌0.5寸針灸針（0.25 mm×13 mm），采用單手進(jìn)針?lè)ㄐ贝蹋ㄖ赶蜓仔圆≡顓^(qū)），深度 4～6 mm，留針20 min，間隔 5 min行針 1次（捻轉(zhuǎn)幅度 90°～180°，捻轉(zhuǎn)頻率 60～90 次 ／min）。模型組：造模成功后予模擬抓取動(dòng)作，不予針刺干預(yù)。其余4組分別選取相應(yīng)的穴位組合進(jìn)行針刺干預(yù)，每日1次，干預(yù)6次。

2.4 取材處理 完成實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，采用10%水合氯醛按2 mL／kg體質(zhì)量進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4 mL，室溫下血液自然凝固10～20 min后，冷凍離心機(jī) 4 ℃、3 000 r／min下離心 20 min，取上清液，置于-80℃冰箱中保存待測(cè)。

2.5 觀(guān)察指標(biāo)及方法

2.5.1 鼠甩尾潛伏期測(cè)定 上述造模成功后，在實(shí)驗(yàn)干預(yù)前后測(cè)定大鼠甩尾潛伏期。將ZH-LUO／B鼠尾測(cè)痛儀連接電源，設(shè)置溫度參數(shù)值40℃，將大鼠距尾根部2～3 cm的位置擺放在光源中。同時(shí)記錄光源點(diǎn)亮至大鼠甩尾時(shí)間數(shù)據(jù)，當(dāng)熱痛覺(jué)達(dá)到大鼠的熱痛閾后，可引發(fā)大鼠甩尾反射，從照射開(kāi)始至甩尾反應(yīng)發(fā)生即為大鼠甩尾潛伏期。造模后各組大鼠在實(shí)驗(yàn)干預(yù)前后測(cè)定，每次測(cè)3次取平均值，即為平均熱痛閾值。

2.5.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)炎性痛大鼠血清SP、PGE2、IL-1β含量。用一抗包被微孔板并制成固相抗體，并向包被單抗的微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記檢測(cè)抗體，溫育30 min；洗板6次后加入酶標(biāo)試劑100 μL溫育30 min；洗板6次后，加入顯色液A、B 各 100 μL 顯色 30 min；加終止液 100 μL；30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算血清標(biāo)本中 SP、PGE2、IL-1β 濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，其中方差齊采用LSD（L）分析，方差不齊采用Games-Howell分析。

3 結(jié) 果

3.1 4組干預(yù)前后平均鼠甩尾潛伏期時(shí)間比較 見(jiàn)表1。

表1 4組干預(yù)前后平均鼠甩尾潛伏期時(shí)間比較（）s

表1 4組干預(yù)前后平均鼠甩尾潛伏期時(shí)間比較（）s

注：與干預(yù)前比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別模型組外關(guān)組外關(guān)加合谷組外關(guān)加合谷、后溪組干預(yù)前7.99±1.28 7.23±1.54 6.93±1.82 7.11±0.97干預(yù)后7.89±1.26 9.88±2.521）2）9.63±1.941）2）8.60±0.731）n 10 10 10 10

3.2 4組大鼠血清SP、PGE2、IL-1β水平比較 見(jiàn)表2。

表 2 4 組大鼠血清 SP、PGE2、IL-1β 水平比較（）pg／mL

表 2 4 組大鼠血清 SP、PGE2、IL-1β 水平比較（）pg／mL

注：與模型組比較，1） P＜0.05。

組別模型組外關(guān)組外關(guān)加合谷組外關(guān)加合谷、后溪組SP 9.50±1.58 3.35±1.931）3.92±3.761）5.59±7.46 IL-1β 23.48±3.66 13.67±8.461）12.15±6.891）14.44±11.18 PGE2 765.72±340.51 385.94±238.781）400.53±180.331）642.14±287.92

4 討 論

近年來(lái)，神經(jīng)-體液-免疫調(diào)節(jié)因在炎性痛中發(fā)揮多靶向、多水平的復(fù)雜關(guān)聯(lián)作用而受到研究者的關(guān)注。SP是一種存在于初級(jí)傳入神經(jīng)元的重要神經(jīng)肽，其既可傳遞傷害性信息到脊髓，也能調(diào)節(jié)外周炎癥［3-4］。SP可作用于炎性白細(xì)胞上的特異性神經(jīng)激肽受體，并參與B細(xì)胞免疫球蛋白合成。研究表明SP可通過(guò)MrgprB2／MrgprX2受體參與肥大細(xì)胞脫顆粒，參與調(diào)節(jié)組織損傷所致的疼痛、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和腫脹［5］。 前列腺素（prostaglandin，PG）是不飽和脂肪酸的衍生物，具有多種生理作用的生物活性物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞膜受到刺激時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生并釋放PG。PG因其不同結(jié)構(gòu)及功能被分為A～I(xiàn) 9種類(lèi)型，其中PGE2是致痛性最強(qiáng)的炎癥反應(yīng)介質(zhì)，與疼痛密切相關(guān)。作為白細(xì)胞介素-1（IL-1）家族的成員之一，由活化的單核／巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中起重要作用［6］。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，針刺可通過(guò)調(diào)整機(jī)體SP、PGE2及IL-1β水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［7-12］。

《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》記載曰：“病在筋，調(diào)之筋，病在骨，調(diào)之骨”。手三陽(yáng)筋經(jīng)上肢部循行在《靈樞·經(jīng)筋》載曰：“手陽(yáng)明之筋……上循臂，上結(jié)于肘外，上臑，結(jié)于肩髃”“手太陽(yáng)之筋……上循臂內(nèi)廉，結(jié)于肘內(nèi)銳骨之后，彈之應(yīng)小指之上”“手少陽(yáng)經(jīng)之筋……上循臂，結(jié)于肘；上繞臑外廉”。因此，手三陽(yáng)筋經(jīng)與肘外、肘內(nèi)銳骨、肘上等部位密切相關(guān)。本研究引入的肢體炎性疼痛模型屬于筋經(jīng)病范疇，臨床常根據(jù)病變部位采用局部取穴，并根據(jù)辨筋（經(jīng)）取穴原則配合鄰近或遠(yuǎn)端腧穴進(jìn)行治療。以腰痛取穴為例，經(jīng)數(shù)據(jù)分析研究表明其取穴配伍主要以局部與遠(yuǎn)端配穴為主，且注重循經(jīng)選穴及特定穴的應(yīng)用［13］。有頸椎病臨床取穴配伍研究表明，不同腧穴配伍的針刺治療均可改善頸部前屈的耐疲勞性，其針刺效應(yīng)與取穴數(shù)目的多少無(wú)關(guān)［14］。腧穴配伍選穴思路相關(guān)研究表明，選穴是研究影響腧穴配伍效應(yīng)的首要任務(wù)［15］，腧穴配伍選穴思路應(yīng)以癥狀及同功穴為切入點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合臨床具體病因病機(jī)、歸經(jīng)、病位及病性而決定主穴及配穴［16］。另有研究表明腧穴配伍研究不能簡(jiǎn)單認(rèn)為基于兩個(gè)或兩個(gè)以上的腧穴配合應(yīng)用，而需基于一定選穴原則及臨床應(yīng)用進(jìn)行研究，優(yōu)選配伍可協(xié)同增效，而無(wú)效的穴位配伍不但不能起上述作用，甚者可能會(huì)影響單穴本身功能的發(fā)揮［17］。

辨經(jīng)取穴作為針刺選穴的經(jīng)典原則，在臨床上被廣泛應(yīng)用于筋經(jīng)病的治療。目前，在筋經(jīng)病取穴配伍研究中多以臨床療效及基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)研究為主［18-23］，較少開(kāi)展相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行機(jī)制分析。同時(shí)，在選穴配伍方面，尚缺乏比較循經(jīng)選取單穴與其配合之間的效應(yīng)差異。本研究結(jié)果顯示外關(guān)組、外關(guān)加合谷組與外關(guān)加合谷、后溪組3組在干預(yù)后均可提高炎性痛大鼠自身痛閾。與模型組比較，外關(guān)組、外關(guān)加合谷組可提高大鼠痛閾值，并降低血清中炎性因子 SP、PGE2、IL-1β 含量（P＜0.05），單穴與其配伍組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可知，基于辨經(jīng)取穴的穴位組合配伍對(duì)炎性疼痛鎮(zhèn)痛作用并不優(yōu)于其單穴應(yīng)用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。