栝樓桂枝湯調(diào)控p38MAPK、Caspase-3減輕MCAO大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

朱曉勤 ，曾建偉 ，胡海霞

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

缺血性腦卒中是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，具有高致殘率、致死率。及時(shí)恢復(fù)缺血腦組織血供是目前治療缺血性腦卒中的有效手段，但同時(shí)缺血再灌注又會引起腦組織自由基過剩、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎癥反應(yīng)等諸多病理現(xiàn)象，從而造成血腦屏障破壞、腦水腫、腦細(xì)胞壞死、凋亡等一系列不可逆損傷［1-2］。因此，如何減輕缺血再灌注損傷已經(jīng)成為目前迫切需要解決的問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要途徑之一，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號傳導(dǎo)通路在調(diào)控腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡方面有重要作用，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐［3］。栝樓桂枝湯來源于《金匱要略》，是治療痙病的中醫(yī)經(jīng)典方劑。臨床上常用栝樓桂枝湯加減治療腦卒中后肢體痙攣，療效較好［4-5］。本研究擬觀察栝樓桂枝湯對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)目、Caspase-3、p38MAPK蛋白表達(dá)的影響，探討栝樓桂枝湯對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠27只，體質(zhì)量240～280 g，SPF級，8～12周齡，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。該實(shí)驗(yàn)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行，許可證號：SYXK（閩）2014-0005。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照國際動物保護(hù)及使用指南的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛、多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；p38MAPK一抗、p-p38MAPK一抗、TUNEL試劑盒（美國Santa Cruz公司）；PVDF膜（美國 Millipore公司）；凝膠配制試劑盒、化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；核蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；RM2015型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；BX51T-PHD-J11奧林巴斯顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BioRad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 栝樓桂枝湯水提液的制備 栝樓桂枝湯藥物組成：栝樓根 30 g，白芍 9 g，桂枝 9 g，生姜 9 g，甘草6 g，大棗12枚，浸泡0.5 h，加5倍量水加熱回流2次，每次1 h，過濾，濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至 1.6 g／mL。

2.2 分組和造模 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將27只造模后大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注損傷模型組（MCAO組）、栝樓桂枝湯組（GLGZD組）各9只。MCAO組和 GLGZD組大鼠參照改良的Zea Longa方法［6］制備大鼠腦缺血再灌注損傷（MCAO）模型，行左側(cè)MCAO手術(shù)。造模前，大鼠禁食24 h。造模時(shí)，先用麻醉劑（10%水合氯醛）按照300 mg／kg進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉完全后，將大鼠用橡皮筋固定至手術(shù)臺，剔除大鼠頸部皮毛，于頸部正中切開長約3 cm的切口，將肌肉鈍性分離，暴露頸總動脈并向上分離頸內(nèi)動脈和頸外動脈主干及分支。將頸總動脈遠(yuǎn)心端和頸外動脈近分叉口出充分結(jié)扎，在頸內(nèi)動脈上預(yù)留一根羊腸線待用，用血管夾夾緊頸內(nèi)動脈近分叉口處，在頸總動脈近動脈分叉處用顯微剪剪一小口，將標(biāo)記好的魚線（在18、20、22 mm 處用筆進(jìn)行標(biāo)記）插入切口，同時(shí)松掉頸內(nèi)動脈上的血管夾，使其緩緩插入頸內(nèi)動脈，直到感覺到有少許阻力即可記錄時(shí)間，一般是從頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處插入約 18～22 mm。用預(yù)留在頸內(nèi)動脈上的線結(jié)扎，用縫合針進(jìn)行皮膚縫合，縫合完成后在暴露魚線上綁一根羊腸線作記號。2 h后將魚線拔出2 cm長度，形成再灌注模型。給大鼠保暖，待其蘇醒后進(jìn)行行為學(xué)評分。Sham組只分離動脈，不進(jìn)行結(jié)扎和插線操作。

2.3 干預(yù) 造模成功后第2天開始給藥，GLGZD組按 14.4 g／（kg·d）予栝樓桂枝湯水提物灌胃，Sham組和MCAO組分別灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。

2.4 神經(jīng)行為學(xué)評分 采用Longa 4分5級評分標(biāo)準(zhǔn)對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行評分，于缺血再灌注后2 h及治療的第7天進(jìn)行評分。5級評分標(biāo)準(zhǔn)為：①0分，無神經(jīng)功能缺損，大鼠活動自如；② 1分，右側(cè)前爪不能完全伸展，有輕度神經(jīng)功能缺損；③2分，自發(fā)行走時(shí)大鼠向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，有中度神經(jīng)功能缺損；④3分，行走時(shí)大鼠身體向右側(cè)傾倒，有重度神經(jīng)功能缺損；⑤ 4分，大鼠不能自發(fā)行走，有意識喪失。1～3分被認(rèn)定為造模成功。

2.5 TUNEL染色 干預(yù)7 d后，將大鼠麻醉后用多聚甲醛灌注固定，迅速在冰上斷頭取腦，取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)，置于4%多聚甲醛中固定24 h，進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯脫蠟和石蠟包埋后，進(jìn)行石蠟切片，片厚約 5 μm，攤片，脫蠟，水化，按 TUNEL 法試劑盒說明的步驟標(biāo)記和顯色，依次用蘇木素和伊紅染色，中性樹膠封片。在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下，用400倍視野進(jìn)行觀察拍照、圖像采集，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞的百分比。

2.6 免疫組織化學(xué)染色 用上述方法分離出完整的腦組織，并將大腦浸泡于4%多聚甲醛液體內(nèi)4℃固定24 h，酒精梯度脫水，二甲苯脫蠟和石蠟包埋后，進(jìn)行石蠟切片，片厚約5 μm，攤片，脫蠟，水化，滴加Caspsae-3一抗、加生物素標(biāo)記二抗后，嚴(yán)格按照 SP法步驟操作，最后中性樹膠封片，在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下，用400倍視野進(jìn)行觀察拍照、圖像采集，計(jì)算Caspase-3陽性細(xì)胞的百分比。

2.7 Western blot檢測 提取大腦皮質(zhì)組織總蛋白，BCA測蛋白溶度后，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后脫脂奶粉封閉1 h，加1∶1 000比例稀釋的兔抗鼠p38一抗，4℃過夜。羊抗兔二抗室溫作用1 h后，ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影。凝膠成像與分析系統(tǒng)采集圖像并檢測蛋白條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 栝樓桂枝湯對MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響Sham組大鼠未見神經(jīng)行為學(xué)缺損癥狀。MCAO組大鼠在治療第1天和治療第7天后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為學(xué)缺損，見圖1。

圖1 3組大鼠不同時(shí)間神經(jīng)行為學(xué)評分比較

3.2 栝樓桂枝湯對MCAO大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞的影響 Sham組偶見凋亡細(xì)胞，MCAO組可見較多的凋亡細(xì)胞，染色的陽性細(xì)胞核呈棕褐色，多為單個(gè)散在分布，主要見于梗死灶周圍。與Sham組比較，MCAO組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)凋亡細(xì)胞百分比明顯增加（P＜0.01）。GLGZD組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核顏色明顯變淺，與MCAO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、圖 3。

圖2 3組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)TUNEL染色結(jié)果（×400）

圖3 3組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)比較

3.3 栝桂枝湯對MCAO大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示：Caspase-3陽性細(xì)胞著色為棕黃色，主要分布在細(xì)胞質(zhì)。與Sham組比較，MCAO組Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01）。經(jīng)過栝樓桂枝湯治療7 d后，GLGZD組Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯減少，與MCAO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖 4、圖 5。

3.4 栝桂枝湯對MCAO大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)p38MAPK蛋白磷酸化表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示：Sham組、MCAO組及GLGZD組p38MAPK總蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其蛋白磷酸化水平發(fā)生了不同程度的改變。與Sham組比較，MCAO組p38MAPK蛋白磷酸化水平明顯升高（P＜0.01）。經(jīng)栝樓桂枝湯治療7 d后，GLGZD組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)p38MAPK蛋白磷酸化表達(dá)降低，與MCAO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖6。

圖4 3組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Caspase-3免疫組化染色圖（×400）

圖5 3組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Caspase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)比較

4 討 論

腦缺血恢復(fù)血供后帶來的再灌注損傷嚴(yán)重影響患者的功能恢復(fù)和生存質(zhì)量，是目前急需解決的問題。腦缺血再灌注損傷涉及復(fù)雜的病理生理過程，研究認(rèn)為，在腦缺血再灌注損傷過程中，興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎癥反應(yīng)等因素單獨(dú)或聯(lián)合作用引起細(xì)胞凋亡和壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能破壞［1－2，7］。 如何有效地抑制因再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡和壞死，促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，是治療腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。Caspase-3是半胱天冬酶家族的重要成員，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，多項(xiàng)研究表明Caspase-3參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程，是腦缺血再灌注損傷中引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。腦缺血時(shí)，Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高，且與細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化一致［8-9］。抑制Caspase-3的活化是減輕腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的有效途徑之一。

圖6 3組大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)p38MAPK蛋白磷酸化表達(dá)比較

近年來研究發(fā)現(xiàn)，絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。在腦缺血再灌注損傷時(shí)，MAPK家族被迅速激活，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等生理過程，介導(dǎo)生長發(fā)育、炎癥反應(yīng)等生命活動［10-12］。p38-MAPK是MAPK家族的重要成員，在應(yīng)激條件下被激活，參與腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)磷酸化p38MAPK在腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中表達(dá)增加，提示腦缺血再灌注損傷可能與p38MAPK信號通路的激活有關(guān)［13-16］。另有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后，p38MAPK蛋白表達(dá)量的高低與細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)，抑制p38MAPK激活可以減輕腦缺血再灌注損傷時(shí)的腦神經(jīng)元凋亡［17-19］?？梢姡琾38MAPK信號通路與腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，p38MAPK被激活可誘導(dǎo)和加重細(xì)胞凋亡的發(fā)生，加劇了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。因此，抑制p38MAPK活化、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是改善腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制之一。

栝樓桂枝湯處方來源《金匱要略》，是治療痙病的常用方，以益津、和血、養(yǎng)筋為治療原則。栝樓桂枝湯在臨床上對改善腦卒中后偏癱患者肢體痙攣狀態(tài)、運(yùn)動功能和生存質(zhì)量有較好的療效［4-5］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)栝樓桂枝湯能降低腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積，改善神經(jīng)形為學(xué)缺陷，對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［20-22］。本研究通過復(fù)制局灶性腦缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)動物模型，經(jīng)栝樓桂枝湯給藥，觀察栝樓桂枝湯對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡、Caspase-3蛋白、p38MAPK蛋白磷酸化表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，栝樓桂枝湯給藥能改善MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)缺陷，降低MCAO大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，減少Caspase-3蛋白表達(dá)、抑制p38MAPK蛋白磷酸化?？梢?，栝樓桂枝湯對腦缺血再灌注損傷腦組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制p38MAPK活化、下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。