林蛙油提升雌激素的機(jī)制研究

趙宏宇,王 玉,劉新宇,宋蓮蓮,史頂聰,邸 琳

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012)

林蛙油為中國(guó)林蛙輸卵管干制品,我國(guó)自宋朝時(shí)期就有使用林蛙油的記載,是珍貴的保健品。林蛙油味甘咸、性平、歸腎、肺經(jīng),具有益精補(bǔ)腎、滋陰潤(rùn)肺的功效[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明,林蛙油在抗疲勞、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力方面有一定的功效[2-5],女性使用后在改善圍絕經(jīng)期癥狀方面有很好的效果[6-7]。林蛙油在改善女性健康方面的作用很可能來(lái)自于其提升雌激素的作用,在林蛙油治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的報(bào)道中[8],患者雖然未能提高骨密度,但血清雌二醇含量卻提升了1倍。很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也報(bào)道服用林蛙油后,動(dòng)物血清雌二醇含量顯著上升[9-10]。關(guān)于林蛙油提升血清雌激素的作用機(jī)制,目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為是外源性地?cái)z入了林蛙油中的雌激素,從而提升了服用者體內(nèi)的雌激素含量。目前通過(guò)液相色譜法檢測(cè)到林蛙油中雌二醇含量大約在3～7.65 μg/g[11-12],因林蛙油產(chǎn)地差異和雌二醇提取方式不同,林蛙油中雌二醇含量有一定差異。但關(guān)于外源激素制備大鼠高雌激素血癥模型的研究[13-14]表明,大鼠長(zhǎng)時(shí)間每日肌肉注射苯甲酸雌二醇1000 μg/kg以上,顯著性提高大鼠血清雌二醇含量。根據(jù)林蛙油中雌二醇含量推算,大鼠灌胃大劑量林蛙油獲得的雌二醇不足2 μg/kg,而且與肌肉注射相比,雌二醇通過(guò)口服途徑效力會(huì)進(jìn)一步降低。從外源激素機(jī)制考慮,林蛙油中的雌二醇不足以將服用者血清雌二醇含量顯著提升。因此推測(cè)林蛙油提升服用者的血清雌激素,不是單純依靠外源攝入林蛙油中的雌激素,而是有作用于性腺軸中“垂體-卵巢”部分的內(nèi)源途徑。為驗(yàn)證這一推測(cè),設(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn),同時(shí)灌胃大劑量林蛙油給正常大鼠和去卵巢大鼠,觀察性激素和卵巢、子宮的組織學(xué)變化,希望通過(guò)本研究初步了解林蛙油提升服用者血清雌激素的機(jī)制是否基于調(diào)節(jié)服用者卵巢功能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WISTRA雌性大鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):NO.201800020868,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(吉)-2016-0003,60只,體質(zhì)量200～230 g) 長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司,由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò),符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定;林蛙油 購(gòu)于吉林省白山市,經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院邸琳主任藥師鑒定為中國(guó)林蛙(Rana temporaria chensinesis David)雌蛙輸卵管干制品;雌二醇、孕酮、促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮、泌乳素測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法) 鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

Smatr3000型科斯邁全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫儀 重慶科斯邁生物科技有限公司;BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HC-3618R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;JA2003B型千分之一電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;Y-2000型電子天平 常熟雙杰測(cè)試儀器廠;九陽(yáng)L18-Y928型攪拌機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物去勢(shì)模型制備及分組 雌性WISTAR大鼠隨機(jī)選取20只分為2組,分別為正常對(duì)照組和正常+林蛙油組。其余大鼠,以戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉,肋骨下沿至骨盆上沿位置除毛備皮,碘伏消毒,在距離肋骨下沿2 cm,距離脊柱2 cm的脊柱兩側(cè),分別切開(kāi)1 cm大小皮膚層切口,從皮膚切口下操作,切開(kāi)小于1 cm的腹腔壁肌肉層切口,切口視野達(dá)到腹腔,拉出卵巢脂肪團(tuán),結(jié)扎卵巢與子宮連接部,摘除雙側(cè)卵巢,腹腔壁肌肉層和皮膚層分層縫合,消毒傷口。術(shù)后及連續(xù)3 d,肌注青霉素(4×104U/kg),以防感染。術(shù)后大鼠飼養(yǎng)15 d,選取傷口完全愈合、體重增長(zhǎng)、外觀狀態(tài)良好的20只大鼠隨機(jī)分為兩組,分別為去勢(shì)對(duì)照組和去勢(shì)+林蛙油組。

1.2.2 林蛙油灌胃溶液的制備及給藥 林蛙油在水中泡發(fā)后膨脹度大于55,且其高濃度的水溶液呈果凍狀[15],不處理難以灌胃,吳朝霞等[16]研究發(fā)現(xiàn)以豆油作為溶劑溶解林蛙油粉末,可將林蛙油灌胃劑量提高10～20倍,但考慮到林蛙油古文記載的療效和多數(shù)的科學(xué)研究中食用方法是以水泡發(fā),因此仍然選擇以水作為溶劑。每日稱(chēng)取林蛙油2～2.2 g置于100倍蒸餾水中4 ℃下泡發(fā)16 h,灌胃前攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢柚量捎霉辔钙鬏p松吸取。正常+林蛙油組和去勢(shì)+林蛙油組每日按20 mL/kg灌胃林蛙油水溶液,林蛙油灌胃劑量等于200 mg(生藥)/kg,劑量換算相當(dāng)于人每日服用2 g林蛙油。正常對(duì)照組和去勢(shì)對(duì)照組每日灌胃同等體積的蒸餾水。連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 動(dòng)物處理及檢測(cè)指標(biāo) 大鼠末次灌胃1 h后以10%水合氯醛溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血,3000 r/min離心1 min分離血清備用;摘取子宮和卵巢(正常對(duì)照組和正常+林蛙油組的卵巢),稱(chēng)量器官濕重,計(jì)算器官指數(shù);子宮和卵巢4%多聚甲醛固定,制作石蠟切片HE染色,400倍顯微鏡下進(jìn)行組織切片檢查;使用試劑盒,利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)、泌乳素(PRL)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 服用林蛙油對(duì)大鼠血清雌二醇、孕酮、促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮、泌乳素含量的影響

結(jié)果如表1所示,血清雌二醇方面,與正常對(duì)照組相比,服用林蛙油的正常大鼠血清雌二醇含量顯著上升(P<0.05),去勢(shì)對(duì)照組大鼠血清雌二醇含量顯著降低(P<0.05),與去勢(shì)對(duì)照組相比,去勢(shì)大鼠+林蛙油血清雌二醇含量無(wú)顯著變化(P>0.05);血清孕酮方面,與正常對(duì)照組相比,服用林蛙油的正常大鼠血清孕酮含量有一定上升趨勢(shì),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),去勢(shì)大鼠血清孕酮含量顯著降低(P<0.05),與去勢(shì)對(duì)照組相比,去勢(shì)大鼠+林蛙油血清孕酮含量無(wú)顯著變化(P>0.05);血清促黃體生成素方面,正常+林蛙油組和去勢(shì)+林蛙油大鼠組血清促黃體生成素含量都有一點(diǎn)下降的趨勢(shì),但各組間大鼠血清促黃體生成素含量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);血清促卵泡生成素方面,與正常對(duì)照組相比,去勢(shì)大鼠血清促卵泡生成素含量有一定下降趨勢(shì),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),正常大鼠和去勢(shì)大鼠+林蛙油后,血清促卵泡生成素含量有一定下降趨勢(shì),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);血清睪酮方面,與正常對(duì)照組相比,服用林蛙油的正常大鼠血清睪酮含量顯著上升(P<0.05),去勢(shì)大鼠血清睪酮含量顯著降低(P<0.05),與去勢(shì)對(duì)照組相比,去勢(shì)+林蛙油大鼠的血清睪酮含量顯著上升(P<0.05);泌乳素方面,與去勢(shì)對(duì)照組相比,去勢(shì)大鼠+林蛙油的血清泌乳素含量顯著上升(P<0.05),其它各組間大鼠血清泌乳素含量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清性激素含量Table 1 Content of serum sex hormone in all

注:*表示正常+林蛙油組、去勢(shì)對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，差異顯著,P<0.05;#表示去勢(shì)+林蛙油組與去勢(shì)對(duì)照組比較，差異顯著,P<0.05;表2、表3同。

表2 各組大鼠子宮、卵巢濕重及器官指數(shù)Table 2 The wet weight and organ index of ovary and uterus in all

雌二醇和孕酮的結(jié)果表明,服用林蛙油確實(shí)有提升正常大鼠血清雌激素的作用,但提升的機(jī)制應(yīng)不同于外源雌激素機(jī)制,而考慮與卵巢功能調(diào)節(jié)相關(guān)。促黃體生成素和促卵泡生成素的結(jié)果表明,服用林蛙油后,正常大鼠和去勢(shì)大鼠的兩種促卵巢激素都出現(xiàn)受抑制的趨勢(shì),提示林蛙油中可能存在類(lèi)似的促激素物質(zhì)。睪酮和泌乳素的結(jié)果表明,服用林蛙油能提升正常大鼠和去勢(shì)大鼠血清睪酮和泌乳素,考慮到去勢(shì)大鼠服用后也有提升效果,這種作用方式可能類(lèi)似外源激素,但本實(shí)驗(yàn)主要研究血清雌激素提升機(jī)制,因此沒(méi)有繼續(xù)考察。

2.2 服用林蛙油對(duì)大鼠子宮、卵巢濕重及器官指數(shù)的影響

結(jié)果如表2所示,去勢(shì)后的大鼠子宮嚴(yán)重萎縮,濕重和子宮指數(shù)都顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。正常大鼠服用林蛙油后,子宮和卵巢的濕重和器官指數(shù)并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(P>0.05)。去勢(shì)大鼠+林蛙油組的大鼠子宮濕重呈現(xiàn)出一定的增長(zhǎng)趨勢(shì),但與去勢(shì)對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

大鼠若長(zhǎng)期給予外源雌激素以致機(jī)體內(nèi)雌激素顯著性升高情況下,子宮作為雌激素受體器官,一般會(huì)出現(xiàn)子宮指數(shù)的增加,而卵巢作為雌激素的分泌器官,功能受抑制,一般會(huì)出現(xiàn)卵巢指數(shù)降低[17-18]。本實(shí)驗(yàn)中,正常大鼠服用林蛙油后血清雌二醇顯著上升,但各器官指數(shù)卻沒(méi)有顯著的變化,并不符合使用外源雌激素的結(jié)果。

2.3 服用林蛙油對(duì)大鼠子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖1所示,正常對(duì)照組、正常+林蛙油組大鼠子宮粘膜上皮為單層柱狀上皮,其下可見(jiàn)部分腺體,粘膜層內(nèi)可見(jiàn)少許嗜酸性粒細(xì)胞,肌層為平滑肌細(xì)胞,外膜光滑。服用林蛙油后,組織形態(tài)無(wú)明顯變化,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度間比較也無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表3;去勢(shì)對(duì)照組大鼠子宮萎縮,體積變小,鏡下可見(jiàn)子宮內(nèi)膜呈單層立方上皮,腺體數(shù)量減少未見(jiàn)分泌,子宮間質(zhì)萎縮,細(xì)胞稀疏;去勢(shì)+林蛙油組大鼠子宮萎縮,體積變小,但相比于去勢(shì)對(duì)照組,子宮內(nèi)膜細(xì)胞層次增加,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度增加,子宮內(nèi)腺體數(shù)量增加,腺體內(nèi)腺細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞厚度增加,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度間比較有明顯差異(P<0.05),見(jiàn)表3。

組別子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度(μm)正常對(duì)照組29.29±4.59正常+林蛙油組27.06±5.79去勢(shì)對(duì)照組13.69±2.93去勢(shì)+林蛙油組 20.16±6.66#

正常大鼠在服用林蛙油前后,子宮組織病理學(xué)檢查中并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度沒(méi)有顯著性的改變。在去勢(shì)大鼠方面,由于沒(méi)有了自身動(dòng)情周期雌激素波動(dòng)的影響,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度增加更直接反映外源雌激素的作用[19],而且結(jié)合組織病理學(xué)檢查,子宮的組織結(jié)構(gòu)改善也支持林蛙油有一定外源雌激素的作用,但綜合血清雌激素檢測(cè)和子宮指數(shù)基結(jié)果,考慮林蛙油有較低的外源雌激素作用,但不足以提升機(jī)體的血清雌激素含量。

如圖2所示,正常對(duì)照組大鼠卵巢切片鏡下可見(jiàn)卵巢表面被覆薄層結(jié)締組織膜,皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)不同發(fā)育階段的各級(jí)卵泡及黃體,卵泡周?chē)鸀槔w維結(jié)締組織間質(zhì),髓質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大血管;正常+林蛙油組大鼠卵巢切片鏡下與正常對(duì)照組接近,但觀察到卵巢內(nèi)黃體數(shù)量多于正常大鼠組卵巢中黃體數(shù)量。

圖2 林蛙油對(duì)正常大鼠卵巢組織病理學(xué)的影響(400×)Fig.2 Effect of RO on ovary pathohistology of normal rats(400×)注:箭頭所指分別為卵泡和新生成的黃體。

卵巢中卵泡排卵后形成黃體,黃體會(huì)大量分泌雌二醇和孕酮[20]。正常大鼠服用林蛙油后,組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)卵巢中黃體增多,與大鼠服用林蛙油后血清雌二醇、孕酮含量升高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互支持,提示林蛙油確實(shí)有作用于性腺軸中“垂體-卵巢”部分的內(nèi)源途徑來(lái)提升機(jī)體雌激素。

3 討論

大鼠血清雌二醇(E2)含量隨著動(dòng)情周期波動(dòng),一般在動(dòng)情間期最低,在動(dòng)情前期和動(dòng)情期達(dá)到最高水平,而血清孕酮(P)含量一般在動(dòng)情后期達(dá)到最高[21]。促黃體生成素(LH)是以腦垂體脈沖式分泌的方式進(jìn)入血液,所以測(cè)定人類(lèi)血清LH需在1 h內(nèi)多次取血混合,以減小誤差[22],本研究選擇一次性的采血方式,LH的含量可能存在一定誤差。本研究中所有大鼠同一天處理采集血清,并未統(tǒng)一所有大鼠處于相同的動(dòng)情周期,在實(shí)際檢測(cè)結(jié)果中,不論是否服用林蛙油,正常大鼠組內(nèi)不同大鼠血清E2和P含量差異很明顯,考慮可能處于不同動(dòng)情周期。但同時(shí)發(fā)現(xiàn),相比于正常對(duì)照組,正常+林蛙油組大鼠組內(nèi)大鼠血清E2和P含量差異更大,這里推測(cè)正常大鼠服用林蛙油后,動(dòng)情期時(shí)血清E2和P含量要升高更多。未來(lái)需進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)情期考察,研究林蛙油提升雌激素機(jī)制以驗(yàn)證以上推測(cè)。

在本研究中,正常大鼠服用林蛙油后,卵巢組織病理學(xué)檢查中觀察到了較多排卵后黃體,康嵐等[9]研究發(fā)現(xiàn),服用林蛙油后大鼠卵巢中閉鎖卵泡增多。一般在一個(gè)動(dòng)情周期中,卵巢中會(huì)有很多卵泡生長(zhǎng)發(fā)育,但只有數(shù)個(gè)卵泡能成熟、排卵,轉(zhuǎn)變成黃體,其它未成熟的卵泡一般會(huì)在之前的階段就停止發(fā)育,最終形成閉鎖卵泡[23]?？梢酝茰y(cè),服用林蛙油后,促使或激活了更多的卵泡生長(zhǎng)發(fā)育,進(jìn)而成熟的卵泡和閉鎖的卵泡相應(yīng)增多,成熟的卵泡增多導(dǎo)致排卵增多同時(shí)生成的黃體數(shù)目也增多了,而過(guò)多的卵泡和黃體都導(dǎo)致血清P和E2的含量明顯上升。但是這個(gè)推測(cè)中林蛙油中起到這個(gè)作用的物質(zhì)并不清楚,結(jié)合大鼠血清LH和促卵泡生成素(FSH)含量都有一定降低趨勢(shì),林蛙油促卵泡功能物質(zhì)應(yīng)不是作用于下丘腦和垂體,而是直接作用于卵巢,且不是LH、FSH的激素,曾考慮一種已用于促排卵藥的物質(zhì)-絨毛膜促性腺激素(HCG),陳曉平等[24]檢測(cè)林蛙油中HCG含量達(dá)到了107.5 μg/g,1 g林蛙油中的HCG含量接近于1個(gè)HCG國(guó)際單位,但此劑量不足以達(dá)到促卵泡發(fā)育的作用。林蛙油是雌性林蛙的排卵前膨大的輸卵管,由于林蛙是兩棲動(dòng)物,且其繁育后代是將未受精的卵排到水中,進(jìn)行體外受精,輸卵管中的物質(zhì)此刻將作為包裹受精卵的物質(zhì),作為提供卵子發(fā)育成熟乃至受精卵發(fā)育的環(huán)境物質(zhì)[25],其中具有某些促卵泡發(fā)育的激素是一個(gè)比較合理的推測(cè),或許因?yàn)閮蓷珓?dòng)物和哺乳動(dòng)物物種不同,促性腺激素的結(jié)構(gòu)有一定差異,并沒(méi)有被檢測(cè)出,但在服用者體內(nèi)可以發(fā)揮作用。總體而言,想要明確物質(zhì)基礎(chǔ)難度較大,沒(méi)有足夠的證據(jù)能證實(shí)這個(gè)推測(cè),需要進(jìn)一步的研究探索。

林蛙油的安全性一直是大家關(guān)心的問(wèn)題[26]。外源雌激素改變內(nèi)分泌會(huì)使年輕女性皮膚狀態(tài)更好,使更年期女性圍絕經(jīng)期綜合征癥狀改善,但同時(shí)患子宮肌瘤甚至宮頸癌等婦科疾病概率也會(huì)增加[27-28]。服用林蛙油一直被認(rèn)為是補(bǔ)充外源雌激素,因此林蛙油是否有外源雌激素同樣的安全性問(wèn)題也是很多實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)[12],小鼠長(zhǎng)期服用林蛙油后,子宮組織中的TβR-I、TβR-II(和子宮內(nèi)膜癌相關(guān))的表達(dá)并沒(méi)有顯著變化,反而卵巢組織中的FSHR(和卵巢早衰、卵巢癌相關(guān))表達(dá)增高,該研究結(jié)果與本研究的推測(cè)相符,服用林蛙油更多是刺激卵巢功能。研究林蛙油安全性問(wèn)題,建議關(guān)注其對(duì)卵巢的過(guò)度刺激及卵巢早衰。

4 結(jié)論

本研究中正常大鼠服用林蛙油后,血清E2和T含量顯著升高,子宮組織檢查未觀察到顯著變化,卵巢組織觀察到黃體增多。去勢(shì)大鼠服用林蛙油后血清E2含量無(wú)明顯變化,T和RPL含量顯著升高,子宮組織檢查中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度顯著增加,且子宮細(xì)胞層次狀態(tài)有改善。綜上考慮林蛙油提升服用者雌激素機(jī)制可能類(lèi)似促性腺激素刺激卵巢中卵泡發(fā)育,同時(shí)也具有一定的外源激素作用。