芹菜素通過抑制NF-κB信號通路緩解高糖對雪旺細(xì)胞的損傷

趙 璐，孫俊波，許 華，付婷婷，徐江雁

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南鄭州 450000；2. 河南省中醫(yī)院內(nèi)科，河南鄭州 450002；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450046)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是2型糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一，主要臨床表現(xiàn)為慢性遠(yuǎn)端對稱性運(yùn)動感覺障礙，是糖尿病患者致殘的主要原因[1]。DPN主要病理基礎(chǔ)是高血糖，以神經(jīng)元的損傷和血管病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明，且現(xiàn)行的治療中尚沒有特效的治療手段。大量研究顯示，雪旺細(xì)胞對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)、再生具有重要作用。因此，以雪旺細(xì)胞為對象研究周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)病機(jī)制和治療措施顯得尤為重要。

芹菜素(apigenin)屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血壓、保護(hù)神經(jīng)元等藥理作用。然而，芹菜素在高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞損傷方面的研究未見報道。本研究通過觀察芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞活性、凋亡以及分泌神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)的影響，為進(jìn)一步研究糖尿病周圍神經(jīng)病變的分子機(jī)制和尋找臨床治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料RSC96雪旺細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM(低糖)培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胎牛血清均購自美國Gibco公司；葡萄糖、胰蛋白酶和芹菜素均購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自上海碧云天公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京嘉美生物公司；TNF-α和TGF兩種ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；兔抗鼠一抗Bcl-2、Bax、NF-κB、β-actin抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體購自美國Abcam公司；酶標(biāo)儀和熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；PCR引物由上海生工公司合成；流式細(xì)胞儀產(chǎn)自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 RSC96雪旺細(xì)胞接種到含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃、50 mL/L CO2以及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，用2.5 g/L胰酶消化傳代。將RSC96細(xì)胞接種并按以下條件分組繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組如下：①對照組(Control組)，DMEM低糖培養(yǎng)基+100 mL/L胎牛血清+5.6 mmol/L葡萄糖；②高糖組(HG組)，DMEM低糖培養(yǎng)基+100 mL/L胎牛血清+50 mmol/L葡萄糖；③芹菜素組(0.1、1.0、10.0 μmol/L Api組)，在HG組培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入終濃度為0.1、1.0、10.0 μmol/L芹菜素。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期RSC96細(xì)胞接種于96孔板中，按1.2.1項(xiàng)的分組條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后加入20 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育3 h，取出培養(yǎng)板，放在搖床上低速振蕩10 min。接著使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處測量各孔的吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3雪旺細(xì)胞凋亡的檢測 取對數(shù)生長期RSC96細(xì)胞接種于6孔板中，按1.2.1項(xiàng)的分組條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入400 μL×Binding Buffer懸浮細(xì)胞。然后加入5 μL Annexin V/FITC混勻，接著加入5 μL PI后再次混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min。網(wǎng)過濾細(xì)胞，15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.4ELISA實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期RSC96細(xì)胞接種于24孔板中，按1.2.1項(xiàng)的分組條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集上清液，按試劑盒說明，采用ELISA實(shí)驗(yàn)方法分別檢測NGF和TNF-α等蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 每孔取2 mL細(xì)胞(1.5×106)接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理與1.2.1項(xiàng)相同，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計檢測RNA的純度及濃度；按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將同一濃度的各組總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成對應(yīng)的cDNA；然后按照qRT-PCR試劑盒說明書，以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR檢測。采用F=2-ΔΔCt計算待測基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 每孔接種2 mL細(xì)胞(1.5×106)于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理與1.2.1項(xiàng)相同，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞用RIPA細(xì)胞裂解液裂解并離心；采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度；然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、NF-κB(1∶500)、p-NF-κB(1∶500)一抗抗體孵育過夜；然后漂洗，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育4 h。利用免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光劑上機(jī)檢測蛋白的表達(dá)。β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞活性的影響

CCK-8結(jié)果顯示(圖1)，與Control組比較，高糖組細(xì)胞活性降低，且在48 h最顯著(P<0.001)。與高糖組比較，低濃度的芹菜素(0.1、1.0 μmol/L)使細(xì)胞活性顯著逐漸升高(P=0.009，P<0.001)。然而，10.0 μmol/L芹菜素對細(xì)胞增殖則沒有明顯作用(P=0.283)。結(jié)果提示，低濃度的芹菜素可以促進(jìn)高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞活性。由于1.0 μmol/L芹菜素能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞活性，因此我們選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞活性的影響

Fig.1 The effect of apigenin on cell viability in RSC96 cells cultured with high glucose (n=3)

與對照組(Control)比較，*P<0.05；與高糖組(HG)比較，#P<0.05。

2.2 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞凋亡的比例明顯高于Control組(P<0.001)。加入1.0 μmol/L芹菜素之后，與高糖組比較，細(xì)胞凋亡比例明顯降低(P<0.001)。Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，與Control組比較，高糖組Bcl-2蛋白水平(P<0.001)和mRNA表達(dá)水平(P<0.001)顯著降低；加入芹菜素之后，與高糖組相比較，Bcl-2蛋白水平(P<0.001)和基因表達(dá)水平(P=0.001)顯著升高。另外，芹菜素抑制高糖條件下Bax基因的蛋白(P<0.001)和mRNA水平(P<0.001)的升高(圖2)。結(jié)果表明，一定濃度的芹菜素抑制高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞凋亡。

圖2 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞凋亡的影響

Fig.2 The effect of apigenin on cell apoptosis in RSC96 cells cultured with high glucose (n=3)

A：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；B、C：qRT-PCR檢測高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞中Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)；D：Western blot檢測高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)；E、F：Bcl-2和Bax的蛋白定量分析結(jié)果。與對照組(Control)比較，*P<0.05；與高糖組(HG)比較，#P<0.05。

2.3 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞NGF和TNF-α表達(dá)的影響ELISA法檢測結(jié)果顯示(表1)，與Control組比較，高糖組NGF表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)。加入1.0 μmol/L芹菜素之后，與高糖組比較，NGF表達(dá)水平顯著升高(P=0.001)，TNF-α表達(dá)水平顯著降低(P=0.001)。以上結(jié)果表明，一定濃度的芹菜素促進(jìn)高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞NGF表達(dá)，并且抑制TNF-α表達(dá)。

表1 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞NGF和TNF-α表達(dá)的影響

組別NGFTNF-αControl組25.230±2.5325.39±3.48HG組9.860±0.98*43.94±4.39*HG+Api組19.380±2.35#31.56±2.76#

與對照組(Control)比較，*P<0.05；與高糖組(HG)比較，#P<0.05。

2.4 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示(圖3)，與Control組比較，高糖組NF-κB蛋白磷酸化水平顯著增加(P<0.001)。與高糖組比較，1.0 μmol/L芹菜素顯著降低NF-κB蛋白的磷酸化水平(P<0.001)。這些結(jié)果表明，一定濃度的芹菜素抑制高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞NF-κB表達(dá)。

圖3 芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

Fig.3 The effect of apigenin on the expression level of NF-κB in RSC96 cells cultured with high glucose

A：Western blot檢測高糖培養(yǎng)條件下RSC96細(xì)胞中p-NF-κB和NF-κB的蛋白表達(dá)；B：蛋白定量分析結(jié)果。與對照組(Control)比較，*P<0.05；與高糖組(HG)比較，#P<0.05。

3 討 論

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)特有的髓鞘形成細(xì)胞，在神經(jīng)損傷修復(fù)再生中發(fā)揮重要作用[2]。當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷時，雪旺細(xì)胞大量增殖，形成Bunner帶并分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與調(diào)控神經(jīng)修復(fù)與再生[3]。長期高血糖可以破壞雪旺細(xì)胞活性，影響受損的周圍神經(jīng)再生，是DPN的重要病理機(jī)制。因此，促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌對DPN的治療具有重要意義。芹菜素，別名芹黃素、洋芹素，主要存在于傘形科植物旱芹中，具有較高的藥用價值。近年來，有關(guān)芹菜素的中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用逐漸受到關(guān)注[4]。ZHANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以促進(jìn)脊髓損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能的恢復(fù)。ANUSHA等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森動物模型中，芹菜素通過抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。HAN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以緩解在蛛網(wǎng)膜下出血引起的腦損傷過程中神經(jīng)元的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的芹菜素可以促進(jìn)高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞的活性，并且抑制其凋亡，而高濃度的芹菜素對高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞的活性沒有促進(jìn)作用，可能與高濃度藥物的細(xì)胞毒性有關(guān)。結(jié)合以上研究結(jié)果，我們推測芹菜素對治療糖尿病周圍神經(jīng)病變有重要作用。

NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，由交感神經(jīng)元及其支配的靶器官的細(xì)胞組織內(nèi)合成釋放，對神經(jīng)的營養(yǎng)、再生、修復(fù)及功能維持等有重要的生物學(xué)意義[8]。DPN患者和動物模型中NGF水平明顯減少，補(bǔ)充外源性NGF有助于DPN神經(jīng)損傷修復(fù)[9]。盛華剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NGF可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK3β和ERK1/2信號通路，降低高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)而發(fā)揮治療DPN的作用。同時，近年來研究發(fā)現(xiàn)DPN與炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，DPN發(fā)展過程中TNF-α表達(dá)顯著升高，抑制TNF-α表達(dá)可以緩解DPN，促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)[11-12]。芹菜素的藥理作用中包括抗炎以及對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，而有關(guān)芹菜素在高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞中NGF和TNF-α表達(dá)水平的影響未見報道。因此，我們通過ELISA法檢測了二者的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度的芹菜素可以促進(jìn)NGF的表達(dá)，并抑制TNF-α的表達(dá)。

NF-κB參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞存活、凋亡等重要的病理生理過程。NF-κB與DPN的病程進(jìn)展密切相關(guān)，其抑制物可以緩解糖尿病神經(jīng)病理病變[13]。封莎等[14]研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素在大鼠局灶性腦缺血再灌注中可以通過調(diào)控TLR4/NF-κB表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。與他們的研究結(jié)果類似，本研究也發(fā)現(xiàn)芹菜素可以抑制高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞中NF-κB的磷酸化水平。提示芹菜素可能是通過降低NF-κB磷酸化水平從而增加高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞的活性，完成神經(jīng)修復(fù)，緩解DPN病程，進(jìn)而發(fā)揮對DPN的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可以增加高糖培養(yǎng)條件下雪旺細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，增加NGF表達(dá)，并抑制TNF-α表達(dá)，推測其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路相關(guān)。此外，芹菜素在DPN動物水平的研究后續(xù)需要進(jìn)一步補(bǔ)充。相信通過對芹菜素在DPN功能以及分子機(jī)制的更深入研究，有望為治療DPN提供一個新方向。