IL-22可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞雙調(diào)蛋白表達(dá)促進(jìn)銀屑病發(fā)病

韓 丹，王 博，王麗娟，劉 瑋，侯衛(wèi)坤，牟寬厚，呂社民，周 艷

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)附屬西安市紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西西安 710054；4. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061)

近年研究發(fā)現(xiàn)，Th22參與了包括尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris, PsV)在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程[1]。IL-22是Th22型細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子，IL-22R1為其特異性受體，IL-22與其結(jié)合后方可發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。IL-22結(jié)合蛋白(IL-22 binding protein, IL-22BP)是IL-22的一種可溶型受體，表達(dá)于單核細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。IL-22BP與IL-22的親和力顯著高于IL-22R1與IL-22的親和力，因此，IL-22BP可以中和IL-22在體內(nèi)的作用[3]。雙調(diào)蛋白(amphiregulin, AREG)是表皮生長(zhǎng)因子家族的成員之一，是一種自分泌生長(zhǎng)因子，也是迄今為止角質(zhì)形成細(xì)胞最豐富的表皮生長(zhǎng)因子受體配體[4]，ZHENG等[5-6]用免疫組化法檢測(cè)到AREG蛋白在銀屑病皮損的高表達(dá)，可促使銀屑病的表皮增殖。LUO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IL-22可上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)細(xì)胞HB-EGF(表皮生長(zhǎng)因子家族成員)表達(dá)，提示IL-22參與了表皮生長(zhǎng)因子家族的調(diào)控功能。目前，尚未見(jiàn)到AREG和IL-22的相關(guān)研究報(bào)道。因而，本實(shí)驗(yàn)分析銀屑病患者皮損中IL-22和AREG表達(dá)水平及其相關(guān)性，并用IL-22刺激培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，觀察AREG的表達(dá)變化，再通過(guò)IL-22BP抑制該反應(yīng)，以期進(jìn)一步闡明IL-22在銀屑病中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象和組織標(biāo)本患者皮膚活檢標(biāo)本取自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科。26例PsV患者(18～71歲)，平均年齡(39.531±12.402)歲，男14例，女12例，均符合PsV的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：1月內(nèi)未接受系統(tǒng)治療，2周內(nèi)未使用過(guò)外用藥物；沒(méi)有免疫抑制劑應(yīng)用史；沒(méi)有嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾患。15例健康人(22～57歲)皮膚為對(duì)照(healthy control, HC)組，平均年齡(36.927±11.594)歲，男8例，女7例。HC組無(wú)銀屑病等皮膚疾患病史或任何其他自身免疫性疾病家族史。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。本研究按照人類(lèi)倫理委員會(huì)程序，遵循赫爾辛基世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)原則，經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。皮膚組織進(jìn)行手術(shù)后，儲(chǔ)存在液氮中，準(zhǔn)備用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)等檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞及試劑HaCaT細(xì)胞(空軍軍醫(yī)大學(xué)皮膚科實(shí)驗(yàn)室，中國(guó))；RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國(guó))，胰蛋白酶及EDTA(四季青公司，中國(guó))；重組人IL-22(Peprotech公司，美國(guó))及IL-22BP(R&D Systems公司，美國(guó))；TRIzol法總RNA抽提試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))；IL-22、IL-22R1、IL-22BP、AREG和β-actin引物(奧克公司，中國(guó))；cDNA試劑盒(Fermentas公司, 加拿大)；SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa公司，日本)；5-Target qPCR Kit(Bio-Rad公司，美國(guó))；兔抗人AREG抗體(Abcam公司，英國(guó))；GAPDH(Santa Cruz公司，美國(guó))；蛋白酶抑制劑(Beyotime公司，中國(guó))；RIPA蛋白裂解液(Cybrdi Biotechnology公司，美國(guó))；蛋白定量BCA試劑盒(中國(guó)健康元生物有限公司，中國(guó))；SDS(Amresco公司，美國(guó))

1.3 角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)與分組HaCaT細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，用37 ℃預(yù)熱的2.5 g/L胰酶+0.5 g/L EDTA進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞傳代2次后，于6孔板中接種細(xì)胞數(shù)量約3×105/孔，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞平穩(wěn)生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，換成無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，分別加入IL-22以及IL-22+IL-22BP(20 ng/mL)培養(yǎng)24 h。每組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為不加藥物的無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后將各組細(xì)胞分別離心，收取沉淀的細(xì)胞。

1.4 RT-qPCR法檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)將1.1項(xiàng)冷凍保存的每個(gè)皮膚組織標(biāo)本放入研缽中，加入液氮以保持低溫，用研杵研磨成粉狀，加入1 mL Trizol；按照標(biāo)準(zhǔn)TRIzol法進(jìn)行RNA抽提；按照Fermentas公司說(shuō)明書(shū)將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；反應(yīng)條件設(shè)定：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，退火20 s，72 ℃ 20 s，總共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為β-actin。所用引物及退火溫度信息見(jiàn)表1。應(yīng)用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ熒光染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，mRNA表達(dá)量用ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。1.3項(xiàng)中各組HaCaT細(xì)胞亦進(jìn)行如上檢測(cè)。

表1 RT-qPCR基因引物信息

Tab.1 Information of gene primers for RT-qPCR

基因名稱(chēng)引物序列(5'-3')產(chǎn)物大小(bp)退火溫度(℃)IL-22ForwardCCTATATCACCAACCGCACCTTCReverseAGATTGAGGGAACAGCACTTCTTC17653IL-22R1ForwardTCCAGCCTCACCACTCACAAGReverseTTCATTTCATCTTCACCACAACTCC13061IL-22BPForwardCAGTGGGTAGCAGGAGAAGGACReverseGGAGAGGCAGTGAGCAGGAG10151AREGForwardCTGCCTTTATGTCTGCTGTGReverseTTTCGTTCCTCAGCTTCTCC10361β-actinForwardTCGTGCGTGACATTAAGGAGAAGReverseAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG17961

1.5 Western blot檢測(cè)AREG的蛋白表達(dá)采用改良型RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.2 mmol/L EDTA，10 g/L sodium deoxycholate，10 mL/L Triton X-100，1 g/L SDS)裂解細(xì)胞30 min，離心30 min。BCA法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加AREG抗體(1∶1 000)1 mL置于4 ℃孵育過(guò)夜。再加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1∶1 000)1 mL，室溫孵育1 h，洗膜、顯影，置UVP成像系統(tǒng)中攝影，分析AREG與GAPDH的條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 IL-22/IL-22R1以及AREG在PsV患者皮損中高表達(dá)RT-qPCR檢測(cè)顯示，PsV(n=26)組皮損中IL-22和IL-22R1的mRNA相對(duì)表達(dá)明顯高于HC組(n=15)(P<0.001)，AREG(14.612±3.571)表達(dá)亦高于HC(P<0.01)，分別升高了36倍、24倍、15倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-22BP表達(dá)與HC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。提示IL-22及AREG均參與PsV的發(fā)病。

2.2 PsV皮損處IL-22和AREG mRNA表達(dá)呈正相關(guān)對(duì)PsV皮損中IL-22/IL-22R1和AREG mRNA水平的相關(guān)性(n=26)分析發(fā)現(xiàn)，僅有IL-22與AREG的mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.49，P<0.05)；IL-22R1與AREG的mRNA水平不相關(guān)(r=0.29，P>0.05，圖2)。提示IL-22有可能影響AREG的表達(dá)水平。

圖1 PsV和患者皮損中IL-22/IL-22R1、IL-22BP以及AREG mRNA的表達(dá)Fig.1 The mRNA of IL-22/IL-22R, IL-22BP and AREG was increased in lesional skin of PsV與HC組比較,**P<0.01,***P<0.001。

圖2 PsV皮損中AREG與IL-22(A)和IL-22R1(B)mRNA表達(dá)的相關(guān)分析

Fig.2 Positive correlation between the mRNA expression of AREG and IL-22(A)/IL-22R1(B) in lesional skin of PsV

2.3 IL-22可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞AREG mRNA和蛋白表達(dá)IL-22干預(yù)HaCaT細(xì)胞時(shí)，AREG mRNA相對(duì)表達(dá)(22.021±3.757)增高22倍(P<0.01)，蛋白灰度表達(dá)(5.917±0.991)增高6倍(P<0.01)；IL-22BP同時(shí)干預(yù)可將IL-22所增加的AREG mRNA表達(dá)下降75.4%(5.422±1.910)(P<0.01)，蛋白表達(dá)下降69.2%(1.825±0.260)(P<0.01，圖3)。這表明，IL-22可以促使HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生AREG，該效應(yīng)可被IL-22BP明顯阻斷。

圖3 IL-22對(duì)HaCaT細(xì)胞AREG mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Fig.3 Effects of mRNA and protein expressions of AREG in HaCaT cells treated with IL-22

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，PsV皮損中IL-22和IL-22R1水平均明顯高于健康人皮膚。提示PsV皮損內(nèi)高表達(dá)IL-22相關(guān)因子，可能為IL-22/IL-22R1介導(dǎo)的免疫失衡所致。有研究表明，IL-22的受體IL-22R1主要表達(dá)于銀屑病的表皮，提示其在銀屑病中的作用仍以角質(zhì)形成細(xì)胞為主[9]。IL-22信號(hào)通路影響自身免疫性疾病多個(gè)分子進(jìn)程。然而，大多數(shù)研究資料并不確定IL-22是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)本身，還是炎癥所伴隨的附屬品[10]。IL-22與IL-17協(xié)同作用可以提高銀屑病患者抗菌肽的表達(dá)[11]，更重要的是，IL-22介導(dǎo)表皮棘層增厚和角質(zhì)細(xì)胞分化異常，而這些改變均為銀屑病特有的病理變化。ZHENG等[9]用IL-22缺陷老鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有IL-22生成時(shí)，IL-23介導(dǎo)的皮膚炎癥明顯減少。MA等[12]在銀屑病小鼠模型注入中和IL-22的抗體后，原皮損所表現(xiàn)的棘層增厚及炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯緩解。然而，對(duì)于IL-22在銀屑病中發(fā)揮的具體功能及其下游參與基因，值得深入探索和研究。

AREG一直在腫瘤研究中受到高度關(guān)注，在多種人類(lèi)癌癥中均有過(guò)表達(dá)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等。在一些異常的表皮增生性皮膚病如銀屑病、日光角化病、疣、角化棘皮瘤和皮膚鱗癌中，其表達(dá)也有所增加[13]。HaCaT細(xì)胞中AREG過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞增殖[14]。LI等[15]發(fā)現(xiàn)AREG轉(zhuǎn)基因小鼠可導(dǎo)致與銀屑病相似的皮膚過(guò)度增殖等表現(xiàn)。AREG在PsV皮損高表達(dá)有可能是通過(guò)與其受體EGFR結(jié)合，在銀屑病的表皮增殖和炎癥級(jí)聯(lián)中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PsV皮損處高表達(dá)的IL-22 mRNA水平則與過(guò)表達(dá)的AREG呈正相關(guān)。如果剔除IL-22高表達(dá)的樣本，盡管存在正相關(guān)趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析認(rèn)為，這種相關(guān)性在IL-22高表達(dá)的銀屑病皮損中更加明顯，而IL-22低表達(dá)的皮損這種正相關(guān)幾乎不存在，提示高表達(dá)的IL-22更有可能影響銀屑病皮損AREG的表達(dá)水平。這提示AREG在某種條件下可能為IL-22的下游信號(hào)之一。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)IL-22可能通過(guò)促使角質(zhì)形成細(xì)胞的AREG的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，進(jìn)一步發(fā)揮其在銀屑病中的促進(jìn)增殖作用。

IL-22BP可通過(guò)與IL-22R1競(jìng)爭(zhēng)而抑制IL-22的上述功能，在本研究細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中，IL-22BP可將IL-22所增加的AREG大部分表達(dá)抵消。IL-22BP又稱(chēng)為IL-22RA2，雖然IL-22BP與IL-22R1鏈具有最高的結(jié)構(gòu)同源性，但I(xiàn)L-22BP對(duì)IL-22的親和力遠(yuǎn)高于IL-22R1，從而阻止IL-22與IL-22R1的結(jié)合[3]。盡管有資料顯示，IL-22-IL-22BP軸失衡與銀屑病皮炎有關(guān)[16]，但內(nèi)源性IL-22BP在影響銀屑病角質(zhì)細(xì)胞功能中的作用仍不清楚。FUKAYA等[3]研究證明，IL-22BP主要在C57BL/6構(gòu)建的咪喹莫特銀屑病小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)，缺乏IL-22BP時(shí)銀屑病樣皮炎的表皮增生和炎癥均會(huì)加重，IL-17A、IL-22、IL-1β、CXCL1、MMP9、S100A7等銀屑病相關(guān)炎性因子均明顯增加，真皮中白細(xì)胞和γδT細(xì)胞明顯增多；IL-22BP治療可減輕銀屑病小鼠皮膚病理和炎癥的嚴(yán)重程度。這些發(fā)現(xiàn)表明，IL-22BP可通過(guò)介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)IL-22信號(hào)的自我調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制。因此，IL-22BP可能成為干預(yù)和治療皮膚自身免疫性和炎癥性疾病的一個(gè)強(qiáng)有力的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-22BP能夠抑制IL-22對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞AREG的調(diào)節(jié)作用，也為未來(lái)銀屑病的新藥研發(fā)提供了新的理論依據(jù)。