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    CNV-seq及染色體核型分析在染色體異常檢測中的比較

    2019-10-24 11:46:40趙明剛王曉巖
    關(guān)鍵詞:核型羊水染色體

    李 翠,趙明剛,賀 芳,王曉巖,李 旭,王 翔

    (1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心;2. 檢驗(yàn)科,陜西西安 710061)

    人體正常染色體受到某些因素影響后可發(fā)生異常改變,包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)畸變。據(jù)報(bào)道,我國每年出生的染色體異?;純杭s10萬,在活產(chǎn)兒中,染色體異常的發(fā)生率為0.5%~1%[1]。

    傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)可以檢測染色體數(shù)目異常及大于10 Mb的片段缺失、重復(fù)、倒位等結(jié)構(gòu)異常,但不能覆蓋全基因組,且常難以判斷異常染色體片段的來源[2]。染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray analysis, CMA)可以提供高分辨率和全基因組范圍內(nèi)染色體不平衡改變的檢測,精確定位異常改變的片段[3-4],但CMA芯片成本較高,且無法檢測探針未覆蓋的染色體區(qū)段。因此,臨床上亟需一種更經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確的方法,以便全面準(zhǔn)確地檢測染色體異常疾病。基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing, CNV-seq)不僅可以檢測CMA芯片平臺(tái)所覆蓋的染色體疾病類型,還可發(fā)現(xiàn)芯片探針無法覆蓋的染色體的微缺失、微重復(fù),且成本較低,重復(fù)性好[5]。

    在本研究中,我們對臨床發(fā)現(xiàn)的42例疑似染色體異常患者進(jìn)行CNV-seq檢測,評估CNV-seq技術(shù)在染色體疾病檢測中的應(yīng)用價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料選取2018年1月-2018年9月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行門診咨詢及染色體檢查的患者42例,包括進(jìn)行外周血染色體檢查的患者5例,進(jìn)行羊水染色體檢查的患者37例,其中男性3例,女性39例,年齡3~38歲(平均年齡19.7歲)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1外周血細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析 患者簽署知情同意書后采集外周血,2 mL EDTA抗凝血用于后續(xù)CNV-seq檢測,4 mL肝素鈉抗凝血進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、制片后,進(jìn)行染色體G顯帶分析。

    1.2.2羊膜腔穿刺及羊水染色體核型分析 患者簽署知情同意書后,在無菌條件下進(jìn)行超聲下引導(dǎo)穿刺羊水20 mL。15 mL羊水離心后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),常規(guī)收獲制片后進(jìn)行染色體G顯帶分析;5 mL羊水用于后續(xù)CNV-seq檢測。

    1.2.3CNV-seq檢測 患者外周血/羊水標(biāo)本進(jìn)行DNA提取,構(gòu)建測序文庫并進(jìn)行質(zhì)控,然后通過HiSeq 2000測序平臺(tái)進(jìn)行CNV-seq檢測。

    1.2.4CNV-seq檢測結(jié)果分析 將染色體全基因組測序檢測到的基因組CNV參照國際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)、International Standards for Cytogenomic Arrays(ISCA)等以及相關(guān)文獻(xiàn)評估CNV是否致病。檢測報(bào)告將嚴(yán)格按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南[6]進(jìn)行CNVs分級。

    2 結(jié) 果

    2.1 染色體核型分析結(jié)果42例標(biāo)本染色體分析分辨率均在320條帶。染色體核型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),共存在8例染色體異常,其中染色體結(jié)構(gòu)異常6例,數(shù)目異常2例,檢出率19.04%。此外,還檢出4例為染色體多態(tài)性變異,其余30例患者染色體核型分析均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。染色體核型分析異常患者臨床資料及檢測結(jié)果見表1。

    表1 染色體核型分析異?;颊叩呐R床資料及檢測結(jié)果

    Tab.1 Clinical information and results of patients with chromosome abnormality confirmed by karyotype analysis

    編號(hào)性別年齡標(biāo)本類型臨床表現(xiàn)核型分析CNV-seq檢測結(jié)果臨床意義P1男3歲外周血生長發(fā)育遲滯,左手通貫掌,陰莖短小46,XY,der(3)t(3;13)(p25;q21),inv(9)matseq[hg19]del (X)(p22.31)(1.68Mb)seq[hg19]del (3)(p26.3p26.2)(3.3Mb)seq[hg19]dup(13)(q21.31q34)(51.32Mb)致病致病致病P2女15歲外周血原發(fā)閉經(jīng),幼稚子宮46,X,der(X)(q?)seq[hg19]del(X)(q21.31q28)( 66.70 Mb)seq[hg19]dup(4)(q21.21q35.2)(109.98 Mb)致病致病P3男10天外周血雙手通貫掌,先心病46,XY,del(18)(q22q23)seq[hg19]del(18)(q22.1q23)(12.94Mb)seq[hg19]dup(4)(q35.2)(3.52Mb)致病意義不明確P4女20歲外周血原發(fā)閉經(jīng)46,X,der(X)(q?)seq[hg19]del(X)(q21.32q28)seq[hg19]dup(X)(p22.33p11.23)致病致病P5男26歲外周血生殖器幼稚,先心病,左眼視網(wǎng)膜脫落47,XY,+marseq[hg19]dup(22)(q11.1q11.23)(8.54 Mb)致病P6女27歲羊水中孕期唐篩高風(fēng)險(xiǎn)47,XN,+mar未見明顯異常/P7女35歲羊水高齡產(chǎn)婦46,X,inv(Y)(p11.2q11.22)未見明顯異常/P8女32歲羊水中孕期唐篩臨界高風(fēng)險(xiǎn)46,XN,t(1;17)(q12;q23)未見明顯異常/

    2.2 CNV-seq檢測結(jié)果42例標(biāo)本均獲得有效的測序結(jié)果。CNV-seq結(jié)果顯示,42例標(biāo)本中,染色體異常7例,檢出率為16.67%。在傳統(tǒng)染色體核型分析檢出的6例染色體結(jié)構(gòu)異常中,CNV-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例存在CNVs;而2例染色體數(shù)目異?;颊咧校?例存在CNV(表1)。在染色體核型分析結(jié)果正常的30例患者中,CNV-seq發(fā)現(xiàn)2例患者存在片段<10 Mb的CNV變化,其中1例檢測結(jié)果判讀為可能致病的CNV,相關(guān)臨床資料及檢測結(jié)果見表2。此外,對染色體核型分析發(fā)現(xiàn)的4例染色體多態(tài)性變異進(jìn)行CNV-seq檢測,均未檢出100 kb以上已知的、明確致病的CNV, 相關(guān)臨床資料及檢測結(jié)果見表3。

    表2 2例CNV<10 Mb的重復(fù)或缺失患者的臨床資料及檢測結(jié)果

    Tab.2 Clinical information and results of two patients with chromosome microdeletion and microduplication

    編號(hào)性別年齡標(biāo)本類型臨床表現(xiàn)核型分析CNV-seq檢測結(jié)果臨床意義P9女28歲羊水B超示脈絡(luò)叢囊腫46,XNseq[hg19]del(1)(q44)(0.32Mb)seq[hg19]del(7)(p21.1)(0.14Mb)意義不明確P10女32歲羊水近親婚配46,XNseq[hg19]dup(15)(q11.2q13.1)(5.76Mb)可能致病

    表3 4例染色體多態(tài)性變異患者的臨床資料及檢測結(jié)果

    Tab.3 Clinical information and results of four patients with chromosome polymorphism

    編號(hào)性別年齡標(biāo)本類型臨床表現(xiàn)核型分析CNV-seq檢測結(jié)果臨床意義變異來源P11女37歲羊水高齡46,XN,22ps-未見明顯異常/父親P12女31歲羊水B超示脈絡(luò)叢囊腫46,XN,14pstk+未見明顯異常/母親P13女27歲羊水B超示腸管回聲增強(qiáng)46,XN,9qh+未見明顯異常/父親P14女41歲羊水不良孕產(chǎn)史46,XN,inv(9)(p12q13)未見明顯異常/父親

    2.3 隨訪本次研究病例中,共對42例患者進(jìn)行了染色體核型分析和CNV-seq檢測,其中外周血染色體檢查的患者5例,羊水染色體檢查的患者37例,對所有的患者進(jìn)行常規(guī)隨訪。37例羊水染色體檢查的患者中,1例選擇引產(chǎn),由于在外院引產(chǎn),未能獲取進(jìn)一步引產(chǎn)情況。其余36位孕婦均已產(chǎn)下表型正常、發(fā)育良好的健康活嬰,但由于嬰兒較小,可能有些表型還未表現(xiàn)出來,我們將會(huì)繼續(xù)跟蹤隨訪。5例外周血染色體檢查的患者均進(jìn)入針對性的臨床治療階段。

    3 討 論

    染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱染色體異常。染色體異常通常表現(xiàn)為先天性智力低下、發(fā)育滯后、多發(fā)畸形、性發(fā)育不全、反復(fù)流產(chǎn)及不孕不育等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,6.7%~21.4%出生缺陷患兒是由染色體畸變引起的[7]。雖然染色體異常與疾病的關(guān)系越來越明顯,但目前診斷染色體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)仍是染色體核型分析。

    染色體核型分析是一種經(jīng)典的遺傳學(xué)檢測技術(shù),檢測步驟相對復(fù)雜,技術(shù)性要求較強(qiáng),且分辨率較低。此外,細(xì)胞生長狀態(tài)、顯帶水平及操作人員的技術(shù)水平均會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,熒光定量PCR技術(shù)(quantitative fluorescent polymerase chain reaction, QF-PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization, FISH)等已逐漸應(yīng)用于臨床檢測中[8-9]。然而,無論是染色體核型分析、QF-PCR,還是FISH檢測,都無法對來源未知的染色體片段及染色體微缺失微重復(fù)進(jìn)行快速有效的鑒別。因此,臨床急需一種高通量、低成本、易操作的檢測技術(shù),以對染色體異常進(jìn)行快速診斷。

    近些年,高通量測序技術(shù)迅猛發(fā)展,極大地推動(dòng)了分子技術(shù)在臨床產(chǎn)前篩查、遺傳病檢測、腫瘤檢測、微生物病原體檢測及器官移植排斥篩查等方面的應(yīng)用[10]。高通量測序技術(shù)又稱下一代測序(next generation sequencing, NGS),是一種直接測序法,能在同一時(shí)間對上百萬DNA片段進(jìn)行測序,大大提高了測序效率。與傳統(tǒng)的染色體核型分析及CMA檢測相比,CNV-seq技術(shù)以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ),無需細(xì)胞培養(yǎng),且不受探針種類及通量的限制,具有檢測范圍廣、操作簡便、通量高及成本低等優(yōu)勢[11]。國內(nèi)外研究者均對CNV-seq技術(shù)的臨床適用性及準(zhǔn)確性進(jìn)行了評估,結(jié)果表明,CNV-seq技術(shù)可應(yīng)用于流產(chǎn)物分析及產(chǎn)前診斷方面[12-13]。2019年4月,《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》指出,CNV-seq技術(shù)可以彌補(bǔ)染色體核型分析和CMA的不足,對于染色體病高風(fēng)險(xiǎn)胎兒,CNV-seq技術(shù)可作為一線產(chǎn)前診斷方法。但是,CNV-seq技術(shù)不能檢測三倍體及多倍體,無法發(fā)現(xiàn)染色體互相易位、倒位等染色體結(jié)構(gòu)重排,且無法檢測雜合性缺失(包括單親二倍體)[14]。

    本研究中,采用傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)對42例患者進(jìn)行常規(guī)染色體分析發(fā)現(xiàn),8例存在染色體異常,其中6例患者為染色體結(jié)構(gòu)異常,2例為染色體數(shù)目異常。同時(shí),利用CNV-seq技術(shù)對這42例患者標(biāo)本進(jìn)行高通量測序分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對于染色體核型分析確診的6例染色體結(jié)構(gòu)異常的患者,CNV-seq發(fā)現(xiàn)其中4例存在基因的CNVs。將檢測到的CNVs參照國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫及相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行致病性評估發(fā)現(xiàn),除其中1個(gè)CNV臨床意義暫不明確外,其余均是明確致病的。4例存在異常CNVs患者中,P1父親染色體正常,母親染色體核型為46,XX,t(3;13)(p25;q21),inv(9),由此可推測P1患者異常核型來源于其母親;其余3例患者家屬拒絕家系調(diào)查,未能獲得患者異常染色體來源。在染色體核型分析結(jié)果正常的30例患者中,CNV-seq還發(fā)現(xiàn)2例患者存在片段<10 Mb的CNVs,其中1例檢測結(jié)果判讀為可能致病的CNV。

    此外,染色體核型分析還發(fā)現(xiàn)4例染色體多態(tài)性變異。有研究指出,染色體多態(tài)性具有引起流產(chǎn)、不孕不育等生殖異常遺傳效應(yīng)[15-16]。但目前對于多態(tài)性引起的生殖異常,還需進(jìn)一步在分子水平進(jìn)行研究。為了排除本研究中發(fā)現(xiàn)的4例染色體多態(tài)性攜帶其他染色體CNV,我們將標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行CNV-seq檢測,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯異常CNV改變。

    綜上所述, CNV-seq技術(shù)克服了現(xiàn)有染色體診斷技術(shù)的缺點(diǎn),能夠快速、準(zhǔn)確地為染色體異?;颊咛峁└鼮樵敿?xì)的臨床檢測信息。尤其對染色體核型分析不能明確診斷的染色體片段,CNV-seq檢測能協(xié)助確定其所涉及的區(qū)帶。因此,對于染色體病患者和高危人群進(jìn)行CNV-seq聯(lián)合染色體核型分析檢測,能為患者提供更為詳細(xì)準(zhǔn)確的臨床診斷,從而為遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供依據(jù)。

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