應(yīng)用富含GC區(qū)SNP分型的序列特異性PCR新方法檢測子宮內(nèi)膜癌特定位點C729T多態(tài)性

王彩鳳，陳 葳，李 旭

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1. 急診科；2. 檢驗科；3. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710061)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是個體中最常見的遺傳變異，被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、疾病相關(guān)基因定位與診斷、藥物的開發(fā)與應(yīng)用等研究中[1]。目前，SNP檢測技術(shù)的傳統(tǒng)方法包括限制性酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)[2-4]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism, SSCP)[5]、等位基因特異性擴增(allele specific amplification, ASA)[6]等，有些檢測過程較為繁瑣，有些特異性較差等[5]。DNA芯片技術(shù)、變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography, HPLC)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)[6]、質(zhì)譜分析(mass spectrometry, MS)等方法，操作簡單、易于自動化，但儀器昂貴，在實驗室難以普及[5]。而且，其結(jié)果都必須由測序法確定SNP的位置及突變類型[7]。

等位基因特異性擴增法檢測較RFLP、SSCP快捷而廉價，但其實驗條件要求較高，需嚴(yán)格控制，否則易出現(xiàn)假陽性[5]。為進一步降低成本與提高檢測的特異性，本研究在等位基因特異性擴增法的基礎(chǔ)上，以檢測子宮內(nèi)膜癌ERα基因富含GC區(qū)SNP 729C>T為例，建立了一種更為簡便、準(zhǔn)確而廉價的檢測富含GC區(qū)的SNP方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象將2000年6月-2007年2月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院、空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、陜西省人民醫(yī)院、陜西省腫瘤醫(yī)院以及西安市第四人民醫(yī)院婦科接受根治性子宮或全子宮切除手術(shù)的22例原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者作為病例組，年齡30～80歲，采集病變組織標(biāo)本。選取同期接受手術(shù)的良性疾病患者42例作為對照組，年齡31～79歲，采集無病變組織標(biāo)本。所有標(biāo)本常規(guī)液氮罐保存。所有患者排除肝腎疾病，取材之前未接受放療、化療及任何激素治療。

1.2 材料與試劑

1.2.1實驗試劑 DNA Marker DL 2000[寶生物工程(大連)有限公司]、50bp DNA Ladder(TIAGEN生物科技有限公司)、DNA提取試劑盒(臨床樣品基因組DNA小量抽提試劑盒SK1341，生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、PCR反應(yīng)試劑盒(2×TaqPCR Master Mix，2×Pfu PCR Master Mix，2×HortstartTaqPCR Master Mix，TIAGEN生物科技有限公司)、PCR產(chǎn)物純化與測序試劑盒(由北京奧克生物技術(shù)有限責(zé)任公司購自ABI公司)、溴化乙錠與溴酚藍(lán)(Sigma)，瓊脂糖凝膠(Biowest公司，上海YITO 公司分裝)、Tris(Amresco)。

1.2.2主要儀器與分析軟件 液氮凍存裝置(DeltaRange IC50R)、核酸蛋白分析儀(Bio-RAD SmartSpec Plus USA)、紫外線凝膠成像分析儀(SYNGENE Bio Imaging System USA)、PCR擴增儀(PERKIN ELMER GeneAmp Pro System 2400)、基因測序儀(北京奧克生物有限公司購自ABI-PRIMTM3730 XL)以及電泳儀(美國BIO-RAD公司)；CHROMAS軟件、BLAST(bl2seq)軟件。

1.3 組織DNA提取按照生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司臨床樣品基因組DNA小量抽提試劑盒說明嚴(yán)格進行操作。

1.4 技術(shù)原理等位基因特異性引物PCR(ASP-PCR)技術(shù)原理：利用單核苷酸多態(tài)性的等位基因位點特異性設(shè)計引物，即設(shè)計其3′端堿基與等位基因位點相應(yīng)堿基相同的、與等位基因位點上游(5′端)的一小段DNA序列相同的引物即上游引物；或者是設(shè)計其3′端堿基與等位基因位點相應(yīng)堿基互補的、并與等位基因位點下游(3′端)的一小段DNA序列互補的引物即下游引物，作為等位基因特異性引物。

1.5 技術(shù)方法的建立將兩對引物分別加入單管中進行PCR擴增，所設(shè)計的兩條特異性引物即內(nèi)引物分別與DNA雙鏈的兩條單鏈相同，其3′端正好與SNP位點重合，由引物的3′端控制著引物的延伸反應(yīng)，根據(jù)延伸產(chǎn)物的條帶確定SNP類型；并通過在引物的3′端區(qū)域倒數(shù)第3位引入一個人為不匹配堿基來提高延伸反應(yīng)的特異性[5]。具體原理見圖1和表1。P1和P2為擴增含ERα Exon3 SNP位點C729T片段的外引物，產(chǎn)物為150 bp，無特異性，為對照擴增產(chǎn)物；S1和S2為SNP特異性引物；S3和S4也是SNP特異性引物，除3′端倒數(shù)第3個堿基突變外，其余序列與S1和S2相同。S1/S3與P2可引導(dǎo)C基因型擴增，產(chǎn)物為70bp；S2/S4與P2可引導(dǎo)T基因型擴增，產(chǎn)物為70 bp；由于3′端的特殊設(shè)計和嚴(yán)格的擴增條件，S1/S3和S2/S4決定擴增產(chǎn)物的特異性。3種擴增產(chǎn)物在體積分?jǐn)?shù)為10 mL/L的瓊脂糖電泳時易于分離、明確識別。

1.6 引物設(shè)計與合成依據(jù)SS-PCR原理，參照SASAKI等[8]方法，通過網(wǎng)站http://ncbi.nlm.nih.gov/，在GenBank獲取ERα Exon3序列，設(shè)計擴增SNP位點C729T的多對引物，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，其序列見表1。SNP位點C729T Exon位置：Exon3；mRNA位置：1021 C/T；DNA位置：AF123495 Exon 3-C237T；突變效果：Silent。

圖1 引物特異性選擇擴增分析ERα Exon3 C729T方法示意圖

Fig.1 Analysis of C729T of Exon 3 in ERα by sequence-specific polymerase chain reaction (SS-PCR)

1.7 富含GC區(qū)序列特異性聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)的建立

1.7.1第1次PCR 以第一對引物P1與P2將22例子宮內(nèi)膜癌與42例對照的所有DNA進行第1次PCR，擴增ERα基因的Exon3得到第1片段。按PCR反應(yīng)試劑盒說明進行操作。

于冰上在0.2 mL滅菌離心管依次加入模板DNA 1～5 μL，P1、P2(10 μmol/L)各1.0 μL、2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μL，補ddH2O至25 μL。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，60 s，退火溫度57 ℃(預(yù)試驗優(yōu)化：由59 ℃開始，每次遞降1 ℃，直到54 ℃)，60 s，延伸72 ℃，60 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸8 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳及成像分析。

表1 擴增ERα基因Exon3片段的引物序列

Tab.1 Amplified primer sequence of Exon3 fragment in ERα gene

Exon3 primers Primer sequenceTm(℃)Size ofamplicon(bp)ERα codingsequenceamplified*GC(%)First-forward primer (P1)5'-TGTCCTCTTGCTTTTAATAG-3'54.0155934-105335.0First-reverse primer (P2)5'-TGGGAGAGATGTACCTACCA-3'60.0934-105350.0Second-C-forward primer (S1)5'-TGCCAGGCCTGCCGGCTCCGC-3'71.5701002-105381.0Second-T-forward primer (S2)5'-TGCCAGGCCTGCCGGCTCCGT-3'69.6701002-105376.2Second-reverse primer (P2)5'-TGGGAGAGATGTACCTACCA-3'60.01002-105350.0Second-M-C-forward primer (S3)5'-TGCCAGGCCTGCCGGCTCGGC-3'71.5701002-105381.0Second-M-T-forward primer (S4)5'-TGCCAGGCCTGCCGGCTCGGT-3'69.6701002-105376.2Second-reverse primer (P2)5'-TGGGAGAGATGTACCTACCA-3'60.01002-105350.0

*ERα 編碼序列參見Genbank M12674。引物序列設(shè)計參見SASAKI等方法[8]。

1.7.2測序 隨機從第1次PCR產(chǎn)物中抽取10例，PCR產(chǎn)物送北京奧科公司按試劑盒操作指南進行PCR產(chǎn)物純化，以第一對引物的上游引物、按照染料終止子循環(huán)測序試劑盒說明應(yīng)用ABI-PRIMTM3730 XL測序。結(jié)果參照GenBank中ERα Exon3編碼序列(AF123495)，用CHROMAS軟件讀取測序彩圖，將所得DNA序列輸入計算機后，利用[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]在線BLAST(bl2seq)軟件對位排列，并輔以人工校對。

1.7.3第2次PCR 以引物S1/S3與P1，S2/S4與P2，以已擴增的第1片段為模板，按PCR反應(yīng)試劑盒(2×Pfu PCR Master Mix/2×TaqPCR Master Mix/2×Hortstart PCR Master Mix)按說明進行操作，擴增ERα基因的Exon3第2片段。

于冰上在0.2 mL滅菌離心管依次加入模板(第1片段DNA稀釋20倍)1 μL、S1/S2或S3/S4(10 μmol/L)均0.25 μL、P2(10 μmol/L)0.5 μL、2×Pfu PCR Master Mix/2×TaqMaster Mix/2×Hortstart PCR MasterMix 6～6.25 μL，補ddH2O至12.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s，退火85 ℃/69.5 ℃/68 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸7 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳及成像分析。

進一步優(yōu)化反應(yīng)條件，將模板、引物濃度以及2×PCR MasterMix的條件改變一個，其余固定，分別優(yōu)化反應(yīng)條件。模板即第1片段DNA：取其原液、10倍稀釋液、20倍稀釋液各1 μL；引物S1、S2與P2(10 μmol/L)分別為0.125、0.25、0.5 μL；2×PCR Master Mix分別為3.125 μL、6 μL、6.25 μL進行擴增。得知最適條件：第1片段DNA 20倍稀釋1 μL；引物S1、S2與P2各0.25 μL；2×PCR Master Mix 6～6.25 μL。

1.8 富含GC區(qū)序列特異性PCR(SSP-PCR)的應(yīng)用——序列特異性PCR用于鑒別Exon3 SNP位點C729T基因型

1.8.1第2次PCR 以優(yōu)化的引物S3與P2、S4與P2和2×HortstartTaqPCR Master Mix，將22例子宮內(nèi)膜癌與42例對照的第1次PCR產(chǎn)物作為模板，進行第2次PCR。按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系總體積12.5 μL，PCR反應(yīng)參數(shù)的退火溫度68 ℃，具體同前。

1.8.2直接測序法檢驗基因型 將上述所有樣本第1次擴增產(chǎn)物(子宮內(nèi)膜癌22例，對照42例)送奧科公司，用第1對引物的上游引物，按試劑盒操作指南進行PCR產(chǎn)物純化、DNA序列測定及分析。操作同前。

2 結(jié) 果

2.1 第1次PCR擴增結(jié)果22例子宮內(nèi)膜癌與42例對照均進行第一次PCR，20 mL/L瓊脂糖凝膠電泳第1次PCR產(chǎn)物成像分析結(jié)果，產(chǎn)物大小均為155 bp。

2.2 第2次PCR擴增結(jié)果對已測序示C/C純合型的10例，用引物S1、S2與P2和2×Pfu PCR Master Mix進行第2次PCR擴增，結(jié)果顯示：當(dāng)退火溫度為60 ℃，始終擴增出S1P2(C)、S2P2(T)片段，均為70 bp，呈C/T雜合型(圖2)。

圖2 用引物S1、S2與P2和Pfu DNA聚合酶第2次PCR的結(jié)果

Fig.2 The results of gel electrophoresis of the second PCR products amplified with 3′base specific primers S1, S2 and Pfu DNA polymerase

M：DNA Marker DL 2000；奇數(shù)孔：4個樣本的C擴增片段，偶數(shù)孔：4個樣本的G擴增片段。

對測序示C/C純合型的10例，用引物S1、S2與P2和2×TaqPCR Master Mix進行第2次PCR擴增，結(jié)果顯示退火溫度49 ℃至85 ℃，于83 ℃以前，始終能擴增出S1P2、S2P2片段，即C/T雜合型，其中80 ℃至83 ℃，S2P2片段(T)較S1P2(C)片段亮度減低；直至85 ℃時，才僅擴增出S1P2片段，即顯示C/C野生型(圖3A、圖3B、圖3C)。

對測序示C/C純合型的10例，用引物S3與P2、S4與P2和2×TaqPCR Master Mix進行第2次PCR擴增，退火溫度依次為60 ℃，62 ℃，69 ℃，69.5 ℃，70 ℃，于退火溫度69.5 ℃之前，顯示C/T雜合型；而于69.5 ℃，結(jié)果顯示與測序顯示C/C野生型一致?？梢姡S著退火溫度的升高，T較C漸淡，特異性漸提高。而70 ℃時C和T均未擴增(圖4A、圖4B)。

圖3 用引物S1、S2與P2和Taq DNA聚合酶及不同退火溫度的PCR結(jié)果

Fig.3 The results of gel electrophoresis of the second PCR products amplified with 3′base specific primers and Taq DNA polymerase in various Tm

M：DNA Marker DL 2000。A，1、2：49 ℃；3、4：59 ℃；5、6：69 ℃；7、8：77 ℃；奇數(shù)孔：S1P2片段(C)；偶數(shù)孔：S2P2片段(T)。B，1、2：不加引物S1、S2的陰性對照；3、4：79 ℃；5、6：80 ℃；7、8：81 ℃；奇數(shù)孔：S1P2片段(C)；偶數(shù)孔：S2P2片段(T)。C，1、2：82 ℃；3、4：83 ℃；奇數(shù)孔：S2P2片段(T) ；偶數(shù)孔：S1P2片段(C)。

對測序示C/C純合型的10例，用引物S3、S4與P2和2×HortstartTaqPCR Master Mix，進行第2次PCR擴增，退火溫度分別為60 ℃、65 ℃、66 ℃、67 ℃、68 ℃，于退火溫度68 ℃之前，均為C/T雜合型，但65 ℃時，S2P2片段(T)較S1P2(C)片段亮度減低；于68 ℃，S2P2片段(T)消逝，僅顯示S1P2(C)片段，即C/C純合型，與測序結(jié)果一致(圖5A、B)。

2.3 序列特異性PCR用于鑒別Exon3 SNP位點C729T基因型結(jié)果

2.3.1第2次PCR 以所有子宮內(nèi)膜癌與對照的第1次PCR產(chǎn)物作為模板，應(yīng)用優(yōu)化的引物S3、S4與P2和2×HortstartTaqPCR Master Mix，進行第2次PCR擴增，結(jié)果顯示，始終擴增出S3P2片段，即C/C野生型，擴增片段為70 bp。說明未發(fā)現(xiàn)Exon3位點C729T SNP(圖6)。

圖4 用引物S3、S4與P2和TaqDNA聚合酶及不同退火溫度的PCR結(jié)果

Fig.4 The gel electrophoresis result of the second PCR products amplified with 3′ base specific primer with a mismatch at the third 3′-terminal base andTaqDNA polymerase at various Tm

A，1、2：67 ℃；3、4：68 ℃；5、6：69.5 ℃；奇數(shù)孔：S3P2片段(C)；偶數(shù)孔：S4P2片段(T)；M：DNA Marker DL 2000。B，1、2：70 ℃；3、4：69.5 ℃；5、6：69 ℃；奇數(shù)孔：S3P2片段(C)；偶數(shù)孔：S4P2片段(T)；M：50 bp DNA Ladder。

圖5 用引物S3、S4與P2和Hortstart DNA聚合酶PCR的結(jié)果

Fig.5 The gel electrophoresis of the second PCR products amplified with 3′ base specific primer with a mismatch at the third 3′-terminal base and Hortstart DNA polymerase at various Tm

A, M: DNA Marker DL 2000；1、2：65 ℃；3、4：60 ℃；奇數(shù)孔：S3P2片段(C)；偶數(shù)孔：S4P2片段(T)。B，M: 50 bp DNA Ladder；1、2：67 ℃；3、4：68 ℃；奇數(shù)孔：S3P2片段(C)；偶數(shù)孔：S4P2片段(T)。

2.3.2直接測序法驗證基因型 所有樣本第1次擴增產(chǎn)物(子宮內(nèi)膜癌22，對照42例)送奧科公司，用第1對引物的上游引物、按試劑盒操作指南進行PCR產(chǎn)物純化、DNA序列測定及分析。均顯示位點C729T基因型為C/C型。

圖6 序列特異性PCR鑒別Exon3 SNP位點C729T基因型結(jié)果

Fig.6 The gel electrophoresis of SS-PCR products amplified with 3′ base specific primer with a mismatch at the third 3′-terminal base and Hortstart DNA polymerase at 68 ℃

M: 50 bp DNA Ladder；奇數(shù)孔：S3P2片段(C)；偶數(shù)孔：S4P2片段(T)。

3 討 論

等位基因特異性擴增法是檢測點突變較快捷的一種方法[6]，但其實驗條件要求較高，需嚴(yán)格控制, 否則易出現(xiàn)假陽性[5,9-10]。因此，本研究在等位基因特異性擴增法的基礎(chǔ)上研究建立了一種準(zhǔn)確、快速而廉價的SNP檢測方法[ 9-10,11-14]，并針對富含GC區(qū)的ERα基因SNP 729C>T擴增進行了方法學(xué)的探討。

等位基因特異性PCR(ASPCR)主要依賴引物的設(shè)計及優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，使得只有完全互補的序列才能擴增。如果錯配位于引物3′末端導(dǎo)致PCR不能延伸，則叫四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)[5,9,15]。本研究建立SS-PCR與四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)相似，與文獻報道一致[9,11-14]；與直接測序結(jié)果進行對照，檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%，說明其檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

3.1 3′端堿基特異性聚合酶鏈反應(yīng)(3′base specific polymerase chain reaction, 3′BS-PCR)的特異性當(dāng)采用僅3′末端一個堿基特異的引物S1和S2測定SNP類型時，于85 ℃前檢測始終出現(xiàn)兩條條帶，即雜合型C/T，與測序結(jié)果顯示的野生純合型C/C不符(圖2、圖3)。考慮原因是該SNP處于富含GC區(qū)，僅3′端一個堿基特異的引物與DNA模板退火時，不足以影響該引物的延伸反應(yīng)。提示3′BS-PCR對富含GC區(qū)的SNP分型的特異性有限。該結(jié)果與汲振余等[16]相似，其在溫度升至61 ℃前對測序預(yù)先檢測為單純變異株的感染卻擴增為兩條帶(顯示變異株與野生株都有的混合感染)。不同的是，其檢測的突變點并非在富GC區(qū)，所以在低于引物Tm值3 ℃時即選擇出合適退火溫度，本課題組經(jīng)過相當(dāng)長時間摸索才達(dá)到與測序一致的結(jié)果，而且適合的退火溫度高達(dá)85 ℃。值得一提的是，這與SASAKI等[8]的結(jié)果有極大差異，其實驗的退火溫度為60 ℃，但我們卻始終不能重復(fù)其實驗結(jié)果，考慮該區(qū)富含C、G(達(dá)81.0%、76.2%)所致。也正因為此，本研究重新設(shè)計該技術(shù)方案并進行探討。

3.2 引入3′端人工錯配堿基提高SNP分析特異性當(dāng)采用引物S3、S4，也就是在一對3′端特異性引物S1、S2的3′端區(qū)域倒數(shù)第3個位點加入1個人工錯配堿基(與模板相同)時，模板CC僅出現(xiàn)一條與等位基因C相一致的電泳條帶，進一步說明特異性引物的3′端在與DNA 模板退火時，僅3′端一個堿基的不同不足以影響該引物的延伸反應(yīng)；當(dāng)3′端區(qū)域有兩個與模板不互補的堿基時，可有效地阻止非特異性延伸反應(yīng)。證明引入3′端人工錯配堿基能有效提高富含GC區(qū)的SNP分型的特異性，這一結(jié)果與其他研究者的結(jié)果相似[12]。同理，如果模板是TT，則僅出現(xiàn)一條與等位基因T相一致的電泳條帶。對雜合子模板CT來說，人工突變堿基的引入不影響檢測結(jié)果而擴增出C和T兩條帶。遺憾的是，本研究樣本沒有檢出雜合型C/T和突變純合型T/T，這被測序結(jié)果證實(圖4、圖5)，因為不存在雜合型C/T和突變純合型T/T。

3.3 不同的聚合酶對特異性擴增反應(yīng)的影響在方法建立之初，本研究應(yīng)用Pfu DNA聚合酶擴增。由于該酶有3′端外切酶活性，雖然具有矯正在PCR時出現(xiàn)的堿基錯配，但恰巧可能使3′端特異性引物相差的一個堿基被切除而失去其特異性，故始終擴增出兩條帶，顯示雜合子C/T(圖2)。隨后，為了采用特異性引物的3′端之開關(guān)控制延伸反應(yīng)的作用，本研究使用無3′端外切酶活性的TaqDNA聚合酶。目前該酶主要有兩大類，即冷啟動酶和熱啟動酶。本研究選擇TiangenTaqDNA聚合酶和HotstartTaqDNA聚合酶，對這兩類無3′端外切酶活性的Taq酶作了對比實驗。同樣采用3′端區(qū)域倒數(shù)第3個位點加入1個人工錯配堿基的特異性引物及同樣的酶濃度，發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶于退火溫度為69.5 ℃(圖4)，而HotstartTaqDNA聚合酶在退火溫度為68 ℃(圖5)時，所得結(jié)果與測序結(jié)果一致。說明二者相差不大。但是，HotstartTaqDNA聚合酶價格較貴，使測定成本增加。提示不同的聚合酶對特異性擴增反應(yīng)的影響不同[15]。

3.4 退火溫度對特異性擴增反應(yīng)的影響退火溫度與引物的Tm值關(guān)系密切，因此，選擇合適的退火溫度非常重要[17]。針對富含GC區(qū)的ERα基因中729突變點來說，所設(shè)計的兩條錯配特異性引物適宜的Tm值為69～70 ℃。當(dāng)退火溫度為68 ℃或69.5 ℃時(圖4、圖5)，可得到較高的特異性擴增產(chǎn)物量和較好的擴增特異性。所以，退火溫度選擇為比特異性引物的Tm 值低1～3 ℃為宜。

3.5 特異性引物濃度對特異性擴增產(chǎn)物的影響為了提高擴增的特異性，以CC為模板，設(shè)計了一系列不同濃度的引物進行實驗比較。在12.5 μL體系中，外引物P1和P2濃度固定為10 μmol/L(10 μmol/L)，量為0.5 μL，兩個特異性引物S1、S2或S3、S4在10 μmol/L的量依次為0、1.25、0.25、0.5 μL。結(jié)果表明，當(dāng)0.25 μL時既提高了特異性擴增，也保證了特異性帶的強度。

3.6 酶濃度的選擇酶的濃度直接影響到擴增的質(zhì)量和產(chǎn)量。酶濃度過高，非特異性擴增帶會增多；酶濃度過低，則會降低靶序列的擴增量。一般來說，在其他PCR條件都調(diào)整至最佳時，每100 μL PCR反應(yīng)體系中含酶1～2.5 U為宜，但酶的用量仍需根據(jù)不同的模板分子或引物進行適當(dāng)調(diào)整[15]。在本實驗12.5 μL的PCR 反應(yīng)體系中，0.6 U或0.625 U的酶用量即可清晰地判斷SNP類型。

3.7 其它因素靶DNA的濃度也很重要。第2次PCR以第1次PCR產(chǎn)物為模板時，如果濃度太高，體系中會有過量的總Mix，不僅電泳時可顯示第1片段，而且可能影響第2片段特異性擴增，出現(xiàn)非特異性片段。我們經(jīng)過選擇將第一片段原液稀釋20倍，12.5 μL體系取1 μL為宜。另外，在擴增實驗中，dNTP濃度、Mg2+濃度與酶的活性相關(guān)[15]。本實驗用的是總Mix，其量主要靠經(jīng)驗摸索。

3.8 與直接測序法在SNPs鑒定的比較本研究所建立的方法操作簡單、周期短、費用低廉，其可靠性進一步被測序法所證實。

檢測SNPs的經(jīng)典方法是RFLP-PCR、SSCP-PCR等[5]，其結(jié)果僅能判斷SNPs的有無，而無法確定多態(tài)位點的堿基類型，需要測序方法最終驗證[7]。測序法檢測SNP的效率達(dá)到100%，但測序檢測SNP的方法花費昂貴。故對一些比較小、外顯子相對較少的基因的SNP鑒定可以直接測序，而對一些較大的、外顯子較多的基因不宜用測序法直接檢測SNP，也不適用于臨床對大量的標(biāo)本進行檢測[5]。

本研究擴增Exon3位點C729T的片段為155 bp，由于擴增片段短，故對所有樣本采用PCR產(chǎn)物直接測序法，以驗證所建立的SS-PCR的準(zhǔn)確性。結(jié)果與大量文獻報道的相似，成功率接近100%[7]。因此，我們認(rèn)為，直接測序是當(dāng)前檢測SNP的最可靠的方法。但也存在費用偏高、過程較繁瑣及周期較長等不足。相信隨著測序技術(shù)的不斷成熟和測序成本的降低，直接測序?qū)笠?guī)模地用于SNP的檢測與分型[7]。

3.9 評價與展望3′BS-PCR法操作簡單，周期短，準(zhǔn)確，費用低廉，適合于檢測已知位點的定點突變，特別適合于大規(guī)模篩查。關(guān)鍵是應(yīng)固定所用試劑及儀器和把握最佳退火溫度。因而應(yīng)在引物、DNA模板濃度、dNTP、Taq聚合酶等嚴(yán)格控制情況下，以測序法證實的已知一定數(shù)量的純合、突變樣本，摸索最佳退火溫度及退火時間[15]。應(yīng)特別注意引物G+C百分含量決定引物Tm，影響退火溫度，因而不同實驗條件下退火溫度和時間亦應(yīng)不同。只要嚴(yán)格掌握最佳實驗條件，本法對于測定點突變具有較好的應(yīng)用價值[10,12,14]。

本研究證明了等位基因?qū)Ｒ恍缘囊锏?′端第3位堿基引入不配對可以降低引物的非特異性延伸。而且，與3′BS-PCR在適合的退火溫度上有著巨大的差異。因此，基于等位基因?qū)Ｒ恍訮CR的實驗方法均可以考慮通過3′端第3位堿基引入不配對來降低非特異性延伸，減少實驗條件優(yōu)化的時間。

本文建立的方法在特異性引物的3′端區(qū)域人為引入一個不匹配堿基，提高了擴增特異性，降低了假陽性率。該方法實現(xiàn)了檢測3種基因型，電泳即可分析，不需要大型儀器，具有快速、簡便、成本低等優(yōu)點[5,12]；目前反應(yīng)體積為12.5μL，如將PCR反應(yīng)體系減小到數(shù)微升，選用96或384孔板對多個樣品同時操作，則可大大提高SNP檢測效率；本方法可用于制備基因快速檢測試劑盒在基層醫(yī)療機構(gòu)推廣使用[11-12]。但該方法僅適于已知的突變；由于該方法對引物設(shè)計要求較高，且涉及多重PCR，優(yōu)化過程較為繁瑣，條件較嚴(yán)格，難以實現(xiàn)高通量自動化檢測。未來若采用自動化的并行液體加入裝置，將更節(jié)省時間。

4 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化序列特異PCR檢測SNP的條件，建立了適合富含GC區(qū)SNP分型的序列特異性PCR方法，成功用于子宮內(nèi)膜癌特定ERα Exon3位點C729T多態(tài)性基因分型，有望推廣應(yīng)用。